應(yīng)用文集｜電荷異構(gòu)體分析“柱”力提高生物制藥關(guān)鍵質(zhì)量屬性

時(shí)間：2022-9-29 閱讀：730

本篇文集將會(huì)深入淺出介紹電荷異構(gòu)體分析，進(jìn)而“柱"力提高生物藥行業(yè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

用于生物分子分析的離子交換(IEX)色譜

提高生物治療性藥物電荷變異體分析

蛋白質(zhì)由含有許多氨基酸的鏈組成，其中幾種氨基酸具有酸性或堿性側(cè)鏈基團(tuán)。因此，蛋白質(zhì)表面上的總電荷可以通過調(diào)節(jié)周圍溶液的 pH 來控制。等電點(diǎn) pI 是蛋白質(zhì)的凈電荷為中性時(shí)的 pH（正電荷數(shù)量等于負(fù)電荷數(shù)量）。如果 pH 低于 pI，則蛋白質(zhì)總電荷為正，可以保留在帶負(fù)電荷的陽(yáng)離子交換吸附劑上；如果 pH 高于 pI，則蛋白質(zhì)總電荷為負(fù)，可以保留在陰離子交換吸附劑上。

圖 1. pH 值對(duì)蛋白質(zhì)凈電荷的影響

由于大多數(shù)蛋白質(zhì)所含的堿性氨基酸多于酸性氨基酸，因此大多數(shù)電荷異構(gòu)體分離需要采用陽(yáng)離子交換。然而，每種蛋白質(zhì)都不相同，找到能夠?qū)崿F(xiàn)所需佳分辨率的條件可能需要相當(dāng)多的優(yōu)化工作。強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱通常更易于使用，但對(duì)于單克隆抗體，弱陽(yáng)離子交換柱可能是實(shí)現(xiàn)所需分離度的唯一途徑。

在開始方法開發(fā)之前，確定目標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) (pI) 是至關(guān)重要的。如果初始流動(dòng)相條件的 pH 值過分接近蛋白質(zhì)的 pI，蛋白質(zhì)就不會(huì)保留在色譜柱上。pH 與主要物質(zhì)的等電點(diǎn)之間的差距應(yīng)為至少 0.5 至 2 個(gè) pH 單位，具體取決于電荷異構(gòu)體 pI 的差異。蛋白質(zhì)可以通過鹽梯度（用高離子強(qiáng)度破壞蛋白質(zhì)在色譜柱上的吸附）或 pH 梯度（蛋白質(zhì)在 pH 等于 pI 時(shí)洗脫）洗脫。

圖 2. 陽(yáng)離子交換的分離機(jī)制

基于離子電荷的分離通常在非變性條件下進(jìn)行

離子交換是一種廣泛使用的方法，根據(jù)離子電荷的差異分離生物分子。它是一種溫和的非變性技術(shù)，不需要有機(jī)溶劑，因此經(jīng)常用于表征天然或活性形式的蛋白質(zhì)，也用于純化。

值得考慮采用一種能夠在方法開發(fā)過程中篩選幾種不同色譜柱的儀器。即使是離子強(qiáng)度和 pH 等方法條件的微小變化，也很難預(yù)測(cè)會(huì)產(chǎn)生怎樣的結(jié)果；這兩個(gè)因素都會(huì)影響蛋白質(zhì)上的凈電荷，如果是弱離子交換色譜柱，還會(huì)影響色譜柱上的凈電荷。建議采用嚴(yán)格的“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)"方針。建議使用開發(fā)矩陣或系統(tǒng)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的軟件。緩沖液顧問軟件可以利用 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色譜的四元 HPLC 泵功能，從而為方法開發(fā)節(jié)約大量時(shí)間。

因此，離子交換技術(shù)適用于分離具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)，但它在分離單個(gè)蛋白質(zhì)的帶電異構(gòu)體方面同樣很有價(jià)值。在越來越重要的生物制藥領(lǐng)域，蛋白質(zhì)通過生物工程生產(chǎn)并從發(fā)酵反應(yīng)中分離出來，帶電異構(gòu)體表示著蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異，因此帶電異構(gòu)體的鑒定非常重要。一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異可能說明糖基化或降解途徑有所變化，例如 C 端殘基缺失或酰胺化/脫酰胺化作用。它們還可能導(dǎo)致穩(wěn)定性或活性發(fā)生改變，并可能引起不良免疫反應(yīng)。離子交換用于在開發(fā)過程中分離和量化電荷異構(gòu)體，也用于生物治療藥物生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證。對(duì)于單克隆抗體 (mAb) 等大分子，還需要考慮分子的大小和結(jié)構(gòu)（mAb 通常為 150 kD），特別是當(dāng)色譜相互作用只會(huì)發(fā)生在表面電荷上時(shí)。