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大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
名詞解釋及原理
1、感受態(tài)細(xì)胞：應(yīng)用一些特殊方法（如點(diǎn)擊法，CaCl2處理）處理后，使細(xì)菌細(xì)胞膜通透性發(fā)生暫時(shí)的改變，處于能允許外源DNA分子進(jìn)入的狀態(tài)，即為感受態(tài)細(xì)胞。
2、轉(zhuǎn)化(Transformation)：是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。
CaCl2轉(zhuǎn)化法的基本原理是細(xì)菌在低溫，低滲（0℃0.1mol/LCaCl2）的溶液中，菌體細(xì)胞膨脹成球形，局部失去細(xì)胞壁或細(xì)胞壁溶解，外來的DNA可形成抗DNase的羥基--鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短暫熱沖擊處理，促使DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。
實(shí)驗(yàn)器材 ①超凈工作臺；②恒溫?fù)u床；③離心機(jī)；④V-1100分光光度計(jì)；⑤水浴鍋；⑥微量移液器。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.感受態(tài)細(xì)胞的制備和保存
制備
（1）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃下3000g離心10分鐘。
（2） 棄去上清,用預(yù)冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置15-30分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。
（3）棄去上清,加入4ml預(yù)冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細(xì)胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。
保存
感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份,貯存于-70℃可保存半年。
轉(zhuǎn)化
（1）從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。
（2）加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。
（3）42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。
（4）向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
（5）將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時(shí),待菌液*被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。
實(shí)驗(yàn)過程圖解
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