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質(zhì)粒DNA提取、純化和鑒定
一、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來(lái)，但兩者變性與復(fù)性所依賴(lài)的溶液pH值不同。在pH值高達(dá)12.0的堿性溶液中，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性；共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不*分離。當(dāng)用pH值4.6的KAc(或NaAc)高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來(lái)的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見(jiàn)的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過(guò)離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清的質(zhì)粒DNA，可用無(wú)水乙醇和鹽溶液，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類(lèi)似，乙醇沉淀DNA的同時(shí)，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNase A將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通過(guò)酚/氯f(wàn)ang抽提除去，后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。
簡(jiǎn)言之：在細(xì)胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA 釋放到溶液中，當(dāng)PH為12時(shí)，DNA的氫鍵斷開(kāi)，由于質(zhì)粒DNA為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所以兩條鏈沒(méi)有分離，而染色體DNA兩條鏈*分開(kāi)，氫鍵斷開(kāi)而分離。當(dāng)PH值恢復(fù)到中性時(shí)，質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來(lái)的共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中-------------除去染色體DNA、大分子RNA和蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物纏連成白色絮狀沉淀，離心分離。
加入乙醇后，上清質(zhì)粒DNA凝聚成沉淀，會(huì)有RNA存在，加入RNA酶，使RNA降解。---------------去除RNA分子。
二、實(shí)驗(yàn)儀器
微量取液器（20、200、1000微升）、臺(tái)式高速離心機(jī)、恒溫震蕩搖床、高速蒸汽消毒器（滅菌鍋）、渦旋震蕩器、電泳儀、瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
堿變性法提取質(zhì)粒DNA一般包括三個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞以擴(kuò)增質(zhì)粒；收集和裂解細(xì)胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。
①細(xì)菌的培養(yǎng)和收集
將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養(yǎng)12-24小時(shí)。用無(wú)菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。 (培養(yǎng)箱、搖床)
②質(zhì)粒DNA少量快速提取
1、取1.5ml培養(yǎng)液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g離心30秒。（移液器、離心機(jī)）
2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘,使液體流盡。
3、菌體沉淀重懸浮于100μl溶液Ⅰ中(需劇烈振蕩),室溫下放置5-10分鐘。（移液器）
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(千萬(wàn)不要振蕩),冰浴5分鐘。（移液器）
5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ,蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩10秒,使沉淀混勻,冰浴中5-10分鐘,4℃下12000g離心5-10分鐘。 （移液器、離心機(jī)）
6、上清液移入干凈eppendorf管中,加入等體積的酚/氯f(wàn)ang(1:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5分鐘。
7、將水相移入干凈eppendorf管中,加入2倍體積的無(wú)水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中20分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。 （冰箱、離心機(jī)）
8、棄上清,將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g離心5-10分鐘。
9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。
10、將沉淀溶于20μl TE緩沖液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。
* 溶液一：重懸菌體，提供緩沖環(huán)境。
溶液二：氫氧化鈉和SDS裂解菌體細(xì)胞壁、在細(xì)胞膜上穿孔，釋放細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒。
溶液三：中和氫氧化鈉、SDS中的鈉被鉀替換，吸附菌體產(chǎn)生沉淀。
③DNA鑒定
實(shí)驗(yàn)儀器
恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，旋渦振蕩器，水浴鍋，1.5mL離心管，50mL離心管，不同型號(hào)的吸頭，微量移液器，微波爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，電子天平，手套，紫外燈，Eppendorf管等。
DNA純度檢測(cè)
（1） 取40mLTAE（1×）于300mL錐形瓶中，加入0.4g瓊脂糖，放入微 波爐內(nèi)使其熔化，60℃時(shí)倒入準(zhǔn)備好的制膠槽中。（微波爐、制膠槽、梳子）
（2） 取5.0μl純化DNA加入1.0μl上樣緩沖液，混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。（移液器、電泳儀）
（3） 點(diǎn)樣完畢后，100V，200mA條件下電泳30min。
（4） 電泳完畢后，進(jìn)行EB染色，用凝膠成像儀拍照，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（凝膠成像系統(tǒng)）