活性氧檢測試劑盒 

包裝規(guī)格 產(chǎn)品編號：Ros100、Ros300、Ros500 規(guī)格：100次、3*100次、5*100次 

儲存條件 4oC 保存，一年有效；-20oC 保存，二年有效； 

產(chǎn)品組成：Ros100-1 DCFH-DA（10mM） 0.1mL                                                                                                                                      Ros100-2 活性氧陽性對照（Rosup, 50mg/mL） 1mL 

產(chǎn)品簡介： 活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種利用熒光探針 DCFH-DA 進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可 以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成 DCFH。而 DCFH 不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì) 胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的 DCFH 生成有熒光的 DCF。檢測 DCF 的熒光就可以知 道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑 Rosup，以便于活性氧的檢測。 Rosup 是一種混合物，濃度為 50mg/mL。 本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。本試劑盒可以測定 100～500 個樣品。 

使用說明： 

1. 裝載探針 對于刺激時間較短（通常為2小時以內(nèi)）的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己 感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對于細(xì)胞刺激時間較長（通常為6小時以上）的細(xì)胞，先用活性氧陽性 對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋 DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入 的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1mL。 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 的DCFH-DA。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。 

收集細(xì)胞后裝載探針：按照1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。 細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi) 孵育20分鐘。每隔3～5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌 細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物 刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ?xì)胞20～30分鐘后 可以顯著提高活性氧水平。

 說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。

2. 檢測對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度 計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。對于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒 光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。 

3. 參數(shù)設(shè)置 使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實(shí)時或逐時間點(diǎn)檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF 的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測DCF。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參 考下圖。 使用活性氧檢測試劑盒(Reactive oxygen species assay kit)顯示 CHO 細(xì)胞內(nèi)活性氧熒光。左圖：CHO 細(xì)胞用試劑盒 配備的活性氧陽性對照處理；右圖：正常 CHO 細(xì)胞。

4. 其它說明 陽性對照可以按照1∶1000的比例使用。例如裝載好探針的細(xì)胞共1mL，可以加入1μL的陽 性對照刺激。通常刺激后20～30分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細(xì) 胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高， 可以適當(dāng)提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當(dāng)降低活性氧陽性對照的 濃度。另外，對于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒有刺激的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1∶2000～ 1∶5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA的濃度為2～5μmol/L。探針裝載的時間也可 以根據(jù)情況在15～60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。 活性氧陽性對照（Rosup）僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧 陽性對照。 

注意事項： 1. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高。 2. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描，以確認(rèn)探針 的裝載情況是否良好。DCF的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請參考上圖。 3. 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。 4. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。5. 定量的話要作標(biāo)準(zhǔn)曲線吧。先做一個不同濃度H2O2氧化DCFA熒光值，做一條標(biāo)準(zhǔn)曲 線，X軸為H2O2濃度，y軸是熒光值，得出一個方程，在看你樣品的熒光值即Y值是多少，對 應(yīng)的X值就是。 6. 有的細(xì)胞裝載探針后細(xì)胞容易漂起來，洗細(xì)胞時實(shí)驗組會吸走一部分細(xì)胞。所以種細(xì)胞時細(xì) 胞量增加一倍，這樣細(xì)胞緊密連接，貼壁比較牢，實(shí)驗組的熒光值就高了。另外的H2DCFDA 很敏感，工作液濃度要低一些，1-2μM就夠啦，濃度太高容易有非特異性染色。這個探針很 不穩(wěn)定，一旦氧化了本底熒光值就會升高，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。 

僅供科學(xué)研究使用，禁止用于它用。