服務簡介

酵母是一種單細胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，能夠耐受較高的流體靜壓，用于表達基因工程產品時，酵母具有與其他真核生物類似的蛋白質分泌途徑，外源基因的分泌表達，不僅方便了表達產物的分離純化，同時也和表達產物的翻譯后加工有關。酵母表達系統(tǒng)由于兼具原核以及真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點，因此利用此系統(tǒng)可高水平表達蛋白。常用的表達系統(tǒng)有釀酒酵母表達系統(tǒng)和甲醇酵母表達系統(tǒng)，而甲醇酵母表達系統(tǒng)較為常見，以畢赤酵母屬(Pichia)應用較多。

釀酒酵母(Saecharomycescerevisiae)被認為是安全性生物，不產生毒素，但釀酒酵母難于高密度培養(yǎng)，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白質，也不能使所表達的外源蛋白質正確糖基化，而且表達蛋白質的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質表達的宿主菌。甲醇酵母表達系統(tǒng)是應用較多，甲醇酵母主要有漢森酵母屬(Hansenula)，畢赤酵母屬(Pichia)，球擬酵母屬(Torulopsis)等，并以畢赤酵母屬(Pichia)應用為主。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質其產量往往可達克級，與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發(fā)生超糖基化。

酵母表達系統(tǒng)是研究真核蛋白質表達和分析的有力工具，一是含有*的強有力的AOX (醇氧化酶基因)啟動子,用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達。二是培養(yǎng)成本低，產物易分離，畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基成本合理，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，期為無機鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產品分離純化。三是外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，外源基因能以高拷貝數整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能得到高表達菌株。四是作為真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。

服務內容

百歐泰生物的酵母分泌表達系統(tǒng)采用的宿主是巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)，該表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應用較多的一種真核表達系統(tǒng)。百歐泰生物酵母分泌表達系統(tǒng)服務項目包括：

①重組酵母表達質粒構建；

②重組質粒電轉化；

③重組表達子篩選；

④小規(guī)模蛋白表達和純化（24培養(yǎng)基培養(yǎng)產物）。

實驗原理

以巴斯德畢赤酵母表達外源基因為例，畢赤酵母中含有兩個乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）分別編碼基因AOX1和AOX2，兩種序列相似。AOX1基因嚴格受甲醇誘導和調控。當甲醇為碳源時，AOX1啟動子可被甲醇誘導，啟動乙醇氧化酶的表達，從而用甲醇進行代謝。甲醇酵母的表達載體為整合型質粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，很容易整合到酵母基因組中，大部分甲醇酵母的表達載體（質粒）中都有甲醇酵母醇氧化酶基因（AOX1），在該基因啟動子(PAOX1)作用下，質粒可用來促進編碼外源蛋白的目的基因的表達。

實驗流程

?將目的基因克隆入畢赤酵母表達載體，收獲陽性重組表達質粒；

?用適當的限制性內切酶消化陽性重組質粒，使之線性化；

?將線性化的陽性重組質粒轉化人巴斯德畢赤酵母菌株（如GS1 15，KM71）；

?將轉化物接種HIS4缺陷平板進行初次篩選；

?用不同濃度的G418平板進行第二輪篩選；

?挑選10~20個克隆進行小規(guī)模誘導培養(yǎng)，鑒定外源基因的表達量；

?挑選高水平表達菌株進行大規(guī)模誘導培養(yǎng)以制備外源基因的表達蛋白質。

實驗服務流程

雙方溝通一致后確定實驗方案，確定服務要求-簽訂合同—預付款-開始實驗-成果交付

相關產品推薦

 重組蛋白   天然蛋白   多肽