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ATCC細胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇實驗方法步驟
一、ATCC細胞  細胞凍存方法

主要操作步驟為：

（1）選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前一天*換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心（1000r/min，10分鐘）。

（2）去上清液，加入含20%小牛血清的*培養(yǎng)基，于4℃預(yù)冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/mL之間。

（3）將上述細胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中，安瓿裝1～1.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要*封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細胞種類及代次、凍存支數(shù)）。

（4）將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內(nèi)；置于液氮容器頸口處存放過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內(nèi)3～4小時（此步可省略），再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時，蕞后沉入液氮中。

細胞凍存在液氮中可以長期保存，但為妥善起見，凍存半年后，*取出一只安瓿細胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長情況，然后再繼續(xù)凍存。

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二、細胞的復(fù)蘇

一、細胞復(fù)蘇的原則

在實際操作中，凍存細胞要進行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。

二、細胞復(fù)蘇的主要操作步驟

(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。

(2)迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其*融化，然后在無菌下取出細胞。

(3)在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。

做細胞實驗的同學看過來。原裝ATCC細胞現(xiàn)貨來啦。 

選擇上海青旗生物細胞有3個理由：

1、細胞狀態(tài)好，形態(tài)佳，易成活，是市面上比較好養(yǎng)的細胞之一;

2、物流迅速，復(fù)蘇好后發(fā)貨，次日就能到;

3、使用我司推薦的進口品牌血清進行培養(yǎng)實驗，效果更佳。

專業(yè)技術(shù)人員李工收藏的細胞培養(yǎng)小技巧:

1. 買細胞要去靠譜的地方買，比如 ATCC 或者青旗生物。一般上面會有針對細胞的介紹，這樣培養(yǎng)之前可以了解細胞正常生長的狀態(tài)圖、傳代、培養(yǎng)基的類型等。

2. 不管是買的細胞，還是別人惠贈的細胞，剛拿到手趕緊的做兩件事：檢測是否有支原體污染;迅速擴增凍存，凍存細胞復(fù)蘇后第二天*更換一次培養(yǎng)基。

3. 發(fā)現(xiàn)細胞有污染迅速處理掉，特別是當你養(yǎng)了很多種細胞時。細菌污染、真菌污染很容易發(fā)現(xiàn)，支原體污染的話，細胞會長的慢，可以買個支原體檢測的試劑盒定期檢測一下。

4. 不同細胞生長周期不同。有的生長很快，比如說 MDA-MB-231，傳代的時候取離心懸液的十分之一就已經(jīng)足夠了。有的又是特別慢，比如 BT474，傳代是一分二，復(fù)蘇起始的時候兩周多才能長滿。這就需要要在培養(yǎng)細胞的過程中多多摸索。

5. 對于嬌弱的細胞，就得細心呵護。胰酶消化不能過久，吹得時候要輕柔，離心時候也要注意轉(zhuǎn)速和時間。每天都要去看一下細胞，肉眼觀察培養(yǎng)基狀況、顯微鏡下觀察細胞生長狀況。記住，是每天。