引言

制備擬胚體

多能性驗證

大限度提高分化效率

結(jié)論

材料

參考文獻(xiàn)

引言

本書論述了在多能干細(xì)胞（PSC）來源的胚胎發(fā)育與分化的生產(chǎn)過程中進(jìn)行三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)的重要性。本文包含了擬胚體（EB）技術(shù)的概述，并就生成擬胚體的不同技術(shù)進(jìn)行了比較。同時，也針對驗證新建立PSC細(xì)胞系多能性的應(yīng)用，對畸胎瘤分析與EB技術(shù)進(jìn)行了比較和討論。后，本文還對近通過3D培養(yǎng)來提升分化效率的文獻(xiàn)進(jìn)行了一個簡短的描述。

制備擬胚體

擬胚體（EB）是PSC的三維聚集物，可以重現(xiàn)胚胎的結(jié)構(gòu)，這也意味著其中包含了完整的三個胚層：外胚層、內(nèi)胚層和中胚層）。EB分化的初始階段與植入后早期胚胎的分化過程極其相似¹。EB當(dāng)中先分化的細(xì)胞類型為原始內(nèi)胚層的外層，這也是分泌出基底膜的一層細(xì)胞。

分泌出來的胞外基質(zhì)包裹著內(nèi)部的原始外胚層細(xì)胞，相當(dāng)于胚胎的外胚層。未與基底膜接觸的原始外胚層細(xì)胞會發(fā)生凋亡現(xiàn)象，進(jìn)而形成一個囊狀結(jié)構(gòu)。在胚胎中，胚外信號中心在外胚層形成了一個精確的原條位點（這也是原腸的起始位點），進(jìn)而形成中胚層與內(nèi)胚層。然而， EB缺少胚外信號中心，因此相比胚胎而言，EB原始外胚層向中胚層與內(nèi)胚層的分化過程顯得混亂和缺乏組織性。兩個研究組提出，EB比之前的猜想更有組織性；如果在正確的時間給予正確的信號，它們的組織性會得到極大提升，進(jìn)而形成與正常胚胎發(fā)育十分相近的過程，其中也包括了原腸胚的形成過程^{2, 3}。這些特性使得EB成為了一個*的模式系統(tǒng)，通過這一系統(tǒng)，可在一個原來難以介入的時間點研究各類胚胎發(fā)育過程，特別在人源細(xì)胞研究中尤其重要。^{4, 5}.

目前可通過多種方法來制備EB，部分方法如圖1所示。這些方法重要的特點是能夠抑制PSC的表面貼壁效應(yīng)，促使它們通過依賴E-鈣粘著蛋白的粘附通路相互粘連起來。

圖1 部分制備擬胚體的方法。圖片源自⁶。

培養(yǎng)皿（靜止）、旋轉(zhuǎn)瓶和低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)容器等懸浮培養(yǎng)裝置易于設(shè)置和維護(hù)，但會形成不同大小的EB，并聚集成各類形狀的團(tuán)塊（圖2）。EB大小增加會降低質(zhì)量傳輸速率⁷。不僅如此，業(yè)界普遍認(rèn)為EB大小和形狀的改變還會改變分化模式⁸。此外，一旦原始內(nèi)胚層開始分泌胞外基質(zhì)，EB就將開始隨機(jī)貼壁（即使是培養(yǎng)皿的疏水表面），這會導(dǎo)致貼壁與懸浮EB的細(xì)胞系出現(xiàn)巨大的特性差異。使用旋轉(zhuǎn)瓶與低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)容器可減少聚集現(xiàn)象，并避免之前所提到的貼壁現(xiàn)象，不過使用這類培養(yǎng)容器需要在懸浮與剪切力造成的細(xì)胞損傷之間找到平衡點⁹。強(qiáng)制聚集培養(yǎng)技術(shù) - 使用圓底低粘附平板、離心管和工程改造的微孔培養(yǎng)皿（圖1中未展示）等容器 - 用戶可通過測定每孔中加入的細(xì)胞數(shù)目，精確控制EB的大小。

圖2 培養(yǎng)于低轉(zhuǎn)速培養(yǎng)容器（A），懸滴培養(yǎng)（B）和在細(xì)菌培養(yǎng)皿中靜態(tài)懸浮培養(yǎng)（C）的EB圖片。請注意懸滴培養(yǎng)的EB在尺寸與形狀上都獲得了的均一度。圖片源自⁹。比例標(biāo)尺 = 500 μM

在微孔和試管中強(qiáng)制聚集培養(yǎng)的缺點之一是，通過剛性的人造塑料界面人為地決定和限制了EB的形狀，進(jìn)而可能影響分化過程¹⁰。同時，從小孔和試管中取出EB而不影響到它們的結(jié)構(gòu)，操作起來也很有難度。圖1所示的優(yōu)勢的方法為懸滴培養(yǎng)。種植細(xì)胞的數(shù)量可控制懸滴EB的大小，EB的形狀也不會受到任何人工塑料基質(zhì)表面的限制。過去建立這些培養(yǎng)體系十分費(fèi)時費(fèi)力，因為您需要在平板的蓋子上制備懸液再反轉(zhuǎn)形成懸滴。為了給EB提供營養(yǎng)，研究人員需要將它們轉(zhuǎn)移至另一個組織培養(yǎng)容器中，通常是細(xì)菌培養(yǎng)皿或低粘附力的培養(yǎng)皿中。

Perfecta3D^® 懸滴培養(yǎng)平板大幅改善了EB制備與培養(yǎng)流程。用戶只需在每個小孔的上方加入一滴細(xì)胞懸液，孔板的幾何構(gòu)造就會引導(dǎo)細(xì)胞和培養(yǎng)基通過一個小洞，進(jìn)而形成一個穩(wěn)定的懸滴。滴入口位于每個培養(yǎng)孔的上方，可用來更換培養(yǎng)基，添加外源胞外基質(zhì)、生長因子、小分子，也可用來加入細(xì)胞形成混合培養(yǎng)物。所有這些選項都為EB的分化操作帶來了極大的便利性與可控性。能方便地為培養(yǎng)物添加養(yǎng)分，意味著懸滴培養(yǎng)物可避免EB聚集或粘附在培養(yǎng)皿底部，從而使培養(yǎng)時間顯著延長。

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細(xì)胞多能性驗證

當(dāng)全新的PSC細(xì)胞系建立時，用戶需對其進(jìn)行評估，以確認(rèn)其真實擁有多能性。對于人源PSC細(xì)胞系而言，傳統(tǒng)的驗證方法是包括體外的多能基因表達(dá)水平驗證、表觀遺傳分析和EB形成分析，以及體內(nèi)的畸胎瘤分析等（圖3）。應(yīng)用于小鼠PSC細(xì)胞系更嚴(yán)格的多能性檢測方法，包括四倍體互補(bǔ)實驗^{11, 12} 及宿主胚泡注射實驗^{13, 14}, 都不適用于人PSC細(xì)胞系。一些科學(xué)家堅持認(rèn)為畸胎瘤分析是驗證人PSC多能性的檢測法，是確定新細(xì)胞系多能性的必要手段。不過，業(yè)界對于畸胎瘤分析所采用的方法存在極大的分歧，都希望建立更為*的標(biāo)準(zhǔn)實驗步驟，從而對新建立的PSC細(xì)胞系之間進(jìn)行結(jié)果比較¹⁵。

圖3 在腎囊下注射PSC所形成的整個畸胎瘤（A）。對包含中胚層（B，C），內(nèi)胚層（D）和外胚層（E，F(xiàn)）的組織切片進(jìn)行蘇木精與曙紅染色分析。圖像源自¹⁶。比例標(biāo)尺 = 100 μM

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)系的制備成功率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高過胚胎干細(xì)胞系，當(dāng)畸胎瘤分析被認(rèn)為十分關(guān)鍵時，該分析就更加顯得費(fèi)力、昂貴和耗時，也需要大量的實驗動物。因此，如果畸胎瘤分析對于證明多能性的作用不可替代，或一組體外檢測就已足夠，那么在此之前對幾個蛋白因子進(jìn)行檢測就顯得十分重要了。

標(biāo)準(zhǔn)化的體外 EB形成操作可獲得大小和數(shù)目*的細(xì)胞，如果和定量細(xì)胞譜系分析方法聯(lián)用，在許多情況下可作為畸胎瘤檢測的有效替代手段（圖4）¹⁷。例如，由于iPSC的生物學(xué)與功能仍處于謹(jǐn)慎研究階段，許多實驗室正在針對人類疾病模型建立多能細(xì)胞系。作為疾病模型的實驗室細(xì)胞系基本無需確定致瘤性，因此進(jìn)行畸胎瘤分析就是浪費(fèi)時間和資源¹⁸。iPSC能否制備出更優(yōu)良的模型至今仍存在頗多爭議，這已超出了此書的論述范圍^19-21。此外，如果特定細(xì)胞類型/組織的胚胎發(fā)育過程已得到充分的研究，人們即可通過定向3D分化（請見下一節(jié)）來評估新建立PSC細(xì)胞系參與“正常”發(fā)育模型的能力，這是在畸胎瘤檢測或自然EB分化操作中無法實現(xiàn)的²²。

圖4 使用蘇木精和曙紅對EB切片進(jìn)行染色，呈現(xiàn)外胚層（A）、中胚層（B）和內(nèi)胚層（C）的分化。圖像源自¹⁷。!!比例標(biāo)尺 = 50 μM。

大限度提高分化效率

部分細(xì)胞類型和組織需3D培養(yǎng)才能實現(xiàn)PSC的大分化效率。胚胎發(fā)育不會發(fā)生在單層細(xì)胞，無數(shù)的研究案例說明了某一胚層的胞外信號如何影響相鄰胚層的特性。例如，心臟特性只會出現(xiàn)在那些暴露于前內(nèi)胚層（所分泌）信號的中胚層細(xì)胞中²³。實際上，相對于2D培養(yǎng)，人類PSC細(xì)胞的心臟分化在3D培養(yǎng)條件下效果更好。這很可能是因為3D培養(yǎng)時信號轉(zhuǎn)導(dǎo)更接近生理狀態(tài)，存在PSC源心臟支持細(xì)胞，同時存在更天然的心肌三維整體結(jié)構(gòu)^{24, 25}。在胚胎發(fā)育過程中，一些外胚層表面區(qū)域會變厚，隨后發(fā)育為感覺器官部分，如眼（光基板）和耳（耳基板）。這些區(qū)域的分化也需要二維培養(yǎng)條件無法方便形成的多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。胚胎發(fā)生的復(fù)雜分化模式在3D培養(yǎng)條件下不會受限，因此在體外可能獲得更好的重復(fù)性。實際上，已有一些案例證明感覺基板擁有令人驚訝的自組織（self-patterned）分化過程：可從精確激活的EB分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞（圖5）和視網(wǎng)膜色素化表皮細(xì)胞^26-28。

圖5 示意簡圖展示了PSC 3D分化為聽覺基板進(jìn)而形成感覺上皮的過程。圖像源自²⁸。

結(jié)論

在3D環(huán)境下培養(yǎng)PSC擁有巨大的優(yōu)勢，不僅可以有效驗證新建立細(xì)胞系的多能性，還能大限度達(dá)到實際的細(xì)胞分化效果。誘導(dǎo)天然EB分化且避免人為干擾的整體性方法是懸滴培養(yǎng)技術(shù)，目前3D Biomatrix公司的Perfecta3D的懸滴培養(yǎng)平板可幫助用戶方便地實現(xiàn)這一操作。用戶可以靈活添加試劑、小分子、胞外基質(zhì)、額外的細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)，同時可以維持懸滴狀態(tài)，從而為創(chuàng)新和改良PSC分化方法提供了更多空間。如需了解關(guān)于3D培養(yǎng)的更多信息，請參見我們的3D細(xì)胞培養(yǎng)知識中心（3D Culture Knowledge Center）： http://3dbiomatrix.com/knowledge-center。
 

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參考文獻(xiàn)

1. Coucouvanis, E. and G.R. Martin, Signals for death and survival: a two-step mechanism for cavitation in the vertebrate embryo. Cell, 1995. 83(2): p. 279-87.
2. ten Berge, D., et al., Wnt signaling mediates self-organization and axis formation in embryoid bodies. Cell Stem Cell, 2008. 3(5): p. 508-18.
3. Fuchs, C., et al., Self-organization phenomena in embryonic stem cell-derived embryoid bodies: axis formation and breaking of symmetry during cardiomyogenesis. Cells, Tissues, Organs, 2012. 195(5): p. 377-91.
4. Desbaillets, I., et al., Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental Physiology, 2000. 85(6): p. 645-51.
5. Zhu, Z. and D. Huangfu, Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development, 2013. 140(4): p. 705-17.
6. Kurosawa, H., Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2007. 103(5): p. 389-98.
7. Van Winkle, A.P., I.D. Gates, and M.S. Kallos, Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs, 2012. 196(1): p. 34- 47.
8. Bauwens, C.L., et al., Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells, 2008. 26(9): p. 2300-10.
9. Rungarunlert, S., et al., Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors. World Journal of Stem Cells, 2009. 1(1): p. 11-21.
10. Giobbe, G.G., et al., Confined 3D microenvironment regulates early differentiation in human pluripotent stem cells. Biotechnology and Bioengineering, 2012. 109(12): p. 3119-32.
11. Kaufman, M.H. and S. Webb, Postimplantation development of tetraploid mouse embryos produced by electrofusion. Development, 1990. 110(4): p. 1121-32.
12. Nagy, A., et al., Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. Development, 1990. 110(3): p. 815-21.
13. Illmensee, K. and B. Mintz, Totipotency and normal differentiation of single teratocarcinoma cells cloned by injection into blastocysts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1976. 73(2): p. 549-53.
14. Rossant, J. and M.W. McBurney, The developmental potential of a euploid male teratocarcinoma cell line after blastocyst injection. Journal of Embryology and Experimental Morphology, 1982. 70: p. 99-112.
15. Gropp, M., et al., Standardization of the teratoma assay for analysis of pluripotency of human ES cells and biosafety of their differentiated progeny. PloS One, 2012. 7(9): p. e45532.
16. Yabut, O. and H.S. Bernstein, The promise of human embryonic stem cells in agingassociated diseases. Aging, 2011. 3(5): p. 494-508.
17. Sheridan, S.D., V. Surampudi, and R.R. Rao, Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells International, 2012. 2012: p. 738910.
18. Buta, C., et al., Reconsidering pluripotency tests: do we still need teratoma assays? Stem Cell Research, 2013. 11(1): p. 552-62.
19. Riggs, J.W., et al., Induced pluripotency and oncogenic transformation are related processes. Stem cells and development, 2013. 22(1): p. 37-50.
20. Soldner, F. and R. Jaenisch, Medicine. iPSC disease modeling. Science, 2012. 338(6111): p. 1155-6.
21. Zhang, Y., et al., A poor imitation of a natural process: a call to reconsider the iPSC engineering technique. Cell Cycle, 2012. 11(24): p. 4536-44.
22. Jaenisch, R. and R. Young, Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming. Cell, 2008. 132(4): p. 567-82.
23. Samuel, L.J. and B.V. Latinkic, Early activation of FGF and nodal pathways mediates cardiac specification independently of Wnt/beta-catenin signaling. PloS One, 2009. 4(10): p. e7650.
24. Pal, R., et al., Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2013. 115(2): p. 200-6.
25. Warren, L., et al., Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell, 2010. 7(5): p. 618-30.
26. Eiraku, M., et al., Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature, 2011. 472(7341): p. 51-6.
27. Nakano, T., et al., Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell, 2012. 10(6): p. 771-85.
28. Koehler, K.R., et al., Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature, published online July10, 2013; doi: 10.1038/nature12298.