一步法RT-PCR（AMV）試劑盒

產(chǎn)品簡介

一步法RT-PCR（AMV）試劑盒用于在總RNA、mRNA等RNA模板的基礎(chǔ)上反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA*鏈，然后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增cDNA的全過程試劑盒。本試劑盒采用了一步反應(yīng)法完成整個RT-PCR反應(yīng)，即RNA－cDNA－PCR反應(yīng)操作在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)過程中不需增加額外的步驟，就可完成整個RT-PCR反應(yīng)?？捎糜跈z測mRNA的表達(dá)水平、克隆特定基因的cDNA斷。同時還提供了PCR反應(yīng)的陽性對照β-actin的上、下游引物。

試劑盒以外自備儀器和試劑
無RNase酶的1.5m L離心管，可調(diào)移液器，PCR儀，無RNase的無菌水，設(shè)計(jì)好的目的基因引物。

保存條件：

-20℃保存，一年有效。

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

操作規(guī)程

1、 使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s。

2、 取滅過菌且無核酸酶的0.2ml PCR管，參考如下表格設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（50 μL反應(yīng)體系）：

3、   輕輕混勻(可以用Vortex在zui低速度輕輕混勻或用移液器吹打混勻)，隨后2000rpm離心20s沉淀液體。

4、   各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始RT-PCR反應(yīng)。

a、     RT反應(yīng)條件：

42℃保溫1 hr

b、   PCR擴(kuò)增條件參考：

  Step1(起始變性)：    94℃ 3min

Step2(變性)：        94℃ 30sec

Step3(退火)：        45～65℃ 30sec

Step4(延伸)：        72℃ 1min

Step5(循環(huán))：        Go To Step2 for 25～35 cycles

Step6(zui終延伸)：    72℃ 10min

Step7(臨時保存)：    4℃ forever

c、    PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時間、循環(huán)數(shù)及鎂離子的濃度等。

d、 Step4(延伸)的時間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度進(jìn)行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長度為1kb，則延伸時間可以設(shè)置為1分鐘，PCR產(chǎn)物的長度為2kb，則延伸時間可以設(shè)置為2分鐘，以此類推。

e、 對于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對于需進(jìn)行半定量或定量的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達(dá)到平臺期

5、   反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液10μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。如果此PCR產(chǎn)物需用于以后實(shí)驗(yàn)，應(yīng)將PCR產(chǎn)物冷凍保存。

一步法RT-PCR（AMV）試劑盒

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一步法RT-PCR（AMV）試劑盒

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