RT-PCR（AMV）試劑盒

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

RT-PCR（AMV）試劑盒用于在總RNA、mRNA等RNA模板的基礎(chǔ)上反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA*鏈，然后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增cDNA的全過程試劑盒。本試劑盒包含了進(jìn)行cDNA*鏈合成和PCR反應(yīng)所需的各種試劑?？捎糜跈z測(cè)mRNA的表達(dá)水平、克隆特定基因的cDNA 斷。試劑盒提供了Oligo(dT)18和隨機(jī)引物這兩種引物，前者適合用于帶有Poly(A)尾的mRNA的反轉(zhuǎn)錄，后者進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特異性引物進(jìn)行cDNA*鏈的合成。同時(shí)還提供了PCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照β-actin的上、下游引物。

試劑盒以外自備儀器和試劑
無RNase酶的1.5m L離心管，可調(diào)移液器，PCR儀，無RNase的無菌水，設(shè)計(jì)好的目的基因引物。

保存條件：

-20℃保存，一年有效。

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

操作規(guī)程

  A、RT反應(yīng)

1、 使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s。

2、 取滅過菌且無核酸酶的0.2ml PCR管，參考如下表格設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（20 μL反應(yīng)體系）：

3、   輕輕混勻(可以用Vortex在zui低速度輕輕混勻或用移液器吹打混勻)，隨后2000rpm離心20s沉淀液體。

4、   如果使用Oligo(dT)18作為引物或使用基因特異性引物，在42℃孵育60分鐘。如果使用隨機(jī)引物作為引物，先在25℃孵育10分鐘，隨后在42℃孵育60分鐘。注意：對(duì)于GC含量比較高的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可以設(shè)置為45℃孵育60min。

5、   70℃孵育10min以失活逆轉(zhuǎn)錄酶并終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

6、   反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以直接用于下一步的PCR反應(yīng)，也可以-20℃凍存以備以后使用。

B、PCR反應(yīng)（50μL體系）

（如客戶需要使用更小量的反應(yīng)體系，試劑加樣量按比例進(jìn)行減少）：

1、   使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s。

2、 取滅過菌的0.2ml PCR管，參考如下表格設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（50 μL反應(yīng)體系）：

（如果有多個(gè)類似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和Taq酶的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時(shí)混合物中也可以包括引物）

3、   輕輕混勻(可以用Vortex在zui低速度輕輕混勻或用移液器吹打混勻)，隨后2000rpm離心20s沉淀液體。

4、   如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油。

5、 各設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。

a、  ,   PCR擴(kuò)增條件參考：

  Step1(起始變性)：    94℃ 3min

Step2(變性)：        94℃ 30sec

Step3(退火)：        45～65℃ 30sec

Step4(延伸)：        72℃ 1min

Step5(循環(huán))：        Go To Step2 for 25～35 cycles

Step6(zui終延伸)：    72℃ 10min

Step7(臨時(shí)保存)：    4℃ forever

b、   PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)及鎂離子的濃度等。

c、 Step4(延伸)的時(shí)間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時(shí)間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為1分鐘，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為2kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為2分鐘，以此類推。

d、 對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確?？梢詳U(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對(duì)于需進(jìn)行半定量或定量的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達(dá)到平臺(tái)期。

6、   反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液10μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。如果此PCR產(chǎn)物需用于以后實(shí)驗(yàn)，應(yīng)將PCR產(chǎn)物冷凍保存。

RT-PCR（AMV）試劑盒

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RT-PCR（AMV）試劑盒

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