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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 20 test、50 test |
|---|---|---|---|
| 貨號(hào) | GE-19001-20、GE-19001-50 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥,綜合 |
Acme-packaging病毒包裝試劑盒
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
詳細(xì)介紹
產(chǎn)品介紹
在包裝重組病毒的過程中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是影響病毒包裝效果的重要一步。本試劑盒是基于CaPO4法開發(fā)的病毒包裝試劑盒，在293T細(xì)胞中有非常好的轉(zhuǎn)染效果。
CaPO4法最初是作為檢測(cè)病毒DNA傳染性的一種技術(shù)而發(fā)展起來的，由CaPO4形成的沉淀通過增強(qiáng)DNA對(duì)細(xì)胞膜的吸附作用，促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)DNA的攝取，從而達(dá)到轉(zhuǎn)染的目的。CaPO4沉淀還限制了哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)DNA酶對(duì)DNA的消化。
本試劑盒包含能夠快速、簡(jiǎn)便、高效地對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的必要試劑，可同時(shí)用于慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝，可在100mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行20-50次轉(zhuǎn)染。Solution 1和Solution2用于形成CaPO4沉淀；Solution3為本公司生產(chǎn)并經(jīng)嚴(yán)格篩選的胎牛血清，用于病毒包裝過程中添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中；Solution 4為病毒包裝增強(qiáng)試劑，可有效提過病毒包裝效率；Solution 5為病毒感染增強(qiáng)試劑，用于靶細(xì)胞感染；Controlplasmid為EGFP慢病毒質(zhì)粒，用于包裝陽(yáng)性對(duì)照病毒。
產(chǎn)品特點(diǎn)
?操作簡(jiǎn)單、快速、高效
產(chǎn)品成分
試劑名稱 | 內(nèi)容 | 規(guī)格 | 儲(chǔ)存 條件 | |
-20T | -50T | |||
Solution 1 | 2.5M CaCl2 | 2ml | 5ml | -20℃ |
Solution 2 | 2×BBS | 10ml | 25ml | |
Solution 3 | Modified Fetal bovine serum | 10ml | 25ml | |
Solution 4 | Packaging Enhancer (1000×) | 100μl | 250μl | |
Solution 5 | Infection Enhancer (1000×) | 100μl | 250μl | |
Controlplasmid | CMV-EGFP | 40μg | 100μl | |
UltrapureH2O | H2O | 10ml | 25ml | 4℃ |
注：Solution 1、Solution 2應(yīng)避免反復(fù)凍融，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況分裝使用。
其他所需材料
超純水
293T (Acme-293T，東嶺生物)
DMEM高糖培養(yǎng)基
Fetal bovine serum (FBSV500，東嶺生物)
磷酸鹽緩沖液 (PBS: 137 mM NaCl, 2.6 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, Adjust the pH to 7.4 with HCl)
操作流程
病毒包裝
1.提前一天消化293T細(xì)胞，重懸于37℃預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基中（10%FBS，無抗生素，以下簡(jiǎn)稱為D10），計(jì)數(shù)；
2.每個(gè)培養(yǎng)皿接種4.5×10^6細(xì)胞，10mlD10，輕輕晃動(dòng)，將細(xì)胞*混勻；
3.在含5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜（轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到60%-70%，可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度對(duì)細(xì)胞接種量作調(diào)整）；
4.轉(zhuǎn)染前3h配制含有2.5% Solution 3的DMEM培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱為D2.5，不含雙抗），37℃預(yù)熱備用；
5.轉(zhuǎn)染前2h吸去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，每皿更換7ml上一步預(yù)熱的D2.5，放入培養(yǎng)箱中備用，注意避免細(xì)胞脫落；
6.準(zhǔn)備渦旋儀，70%酒精擦拭消毒后置于無菌操作臺(tái)備用；
7.根據(jù)下表準(zhǔn)備DNA混合液（該體系以慢病毒包裝載體pMD2G和psPAX為例，為1個(gè)100mm培養(yǎng)皿用量)：
試劑 | 用量 |
pMD2G | 6μg |
PSPAX | 15μg |
慢病毒表達(dá)載體 | 20μg |
H2O | Add H2O to 450μl |
8.邊渦旋邊逐滴加入50μl Solution 1，以充分混勻；
注：以上所用試劑均需恢復(fù)至室溫，陽(yáng)性對(duì)照組用CMV-EGFP代替慢病毒表達(dá)載體。
9.在15ml離心管中準(zhǔn)備等體積500μl Solution 2，在渦旋儀上快速渦旋，同時(shí)逐滴加入配制好的DNA混合液（該過程必須逐滴加入）；滴加結(jié)束后再渦旋5-10s；
注：因Solution 2 pH對(duì)溫度非常敏感，必須恢復(fù)至室溫后使用。10.將混合液室溫孵育20min；
11.同時(shí)，在待轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入8μl Solution 4，混勻后放于培養(yǎng)箱備用；
12.孵育結(jié)束后用移液槍或移液管輕輕混勻混合液，此時(shí)可見混合液略有渾濁；
注：混勻一定要輕柔，可通過吹泡泡(bubble mix）的方式混勻。13.將混合液逐滴均勻滴加至培養(yǎng)皿中，前后左右輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，充分混勻；
14.將培養(yǎng)皿放于含3%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
15.12-16h之后（不超過16h），37℃預(yù)熱DMEM無血清培養(yǎng)基（可用PBS代替）和D2.5；
16.吸去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用預(yù)熱的DMEM無血清培養(yǎng)基輕輕洗2次，10ml/次，之后加入10ml上步預(yù)熱的D2.5，混勻后置于含5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)；
17.轉(zhuǎn)染36-48h后收集培養(yǎng)上清，2200rpm，4℃離心10min去除細(xì)胞碎片，置于4℃冰箱短期保存（不超過2天），或分裝后于-80℃長(zhǎng)期保存。
注：凍存的病毒應(yīng)在冰上或4℃解凍，且避免反復(fù)凍融。18.收集的病毒上清可直接用于滴度測(cè)定，或濃縮后分裝保存；
本公司同時(shí)提供病毒濃縮試劑（貨號(hào)：GE-19002-50），可方便快捷高效地濃縮病毒，不需要超速離心機(jī)。
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