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【產(chǎn)品規(guī)格】

BPT50  50T（50人份，分五個**包裝）

【產(chǎn)品說明】

端粒酶（Telomerase）是一種酶促核糖**白復(fù)合物。其催化亞基（TERT）具有逆轉(zhuǎn)錄酶的特性，TERT被認(rèn)為是端粒酶活性表達的關(guān)鍵組分，其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致，與端粒酶的活化程度密切相關(guān)。因此，對端粒酶催化亞基的檢測可以間接反映樣本中端粒酶活性。

本產(chǎn)品試劑KIT采用雙色熒光qPCR（TaqMan探針法）檢測端粒酶催化亞基TERT基因和內(nèi)參基因***DH。通過提取細胞RNA，利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以cDNA為模板在單管中利用多重?zé)晒舛縋CR進行擴增反應(yīng)（雙重探針：FAM、Cy5）。選用293T細胞為陽性對照以及MRC-5細胞為陰性對照，通過??CT法檢測樣本中TERT基因的相對表達量。該試劑KIT具有以下特點：

1. 靈敏：雙色探針，靈敏度高。

2. 穩(wěn)定：全程閉管操作，無交叉污染。

3. 可靠：含內(nèi)參基因，避免假陰性。

4. 方便：操作簡單，無需電泳步驟。

5. 定量：以CT值判斷，可定量檢測。

【運輸及保存條件】

低溫冷凍運輸，避光-20℃保存，保質(zhì)期6個月。開蓋后，4℃保存，保質(zhì)期1周。

【產(chǎn)品組分】

注：1.本試劑盒提供試劑，使用前先低速離心、后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起         泡，并低速短暫離心后使用；

2.為了避免反復(fù)凍融，10 人份/管作為一個包裝。

【操作步驟】

1. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

使用Trizol法抽提細胞RNA，RNA純度A260/280在1.9-2.0之間。取1ug RNA使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑KIT（貨號：K1622），將試

劑KIT中的Random Primer替換成Biowing®Specific Reverse Transcription  Primers進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。

1.1 DNase I處理

                 反應(yīng)程序：37℃ 30min；加EDTA 1 µL 后，65℃，10min

1.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)      

反應(yīng)程序：20℃ 10min；42℃ 1h；72℃ 5min

2. qPCR反應(yīng)體系及條件

2.1 陽性對照處理

將陽性對照cDNA進行2倍、4倍的梯度稀釋，每個梯度建議三重復(fù)。

2.2 陰性對照處理

將陰性對照cDNA進行2倍、4倍的梯度稀釋，每個梯度建議三重復(fù)。

2.3 樣本處理

將待測樣本cDNA進行2倍稀釋作為測試濃度，每個樣本做三重復(fù)。

  反應(yīng)體系（以20µL為例）      

PCR儀設(shè)置（以ABI 7500為例）      

【基線設(shè)置】（以ABI 7500為例）

一般默認(rèn)起始和終止基線位置為3-15個循環(huán)，應(yīng)根據(jù)內(nèi)參基因和TERT基因?qū)嶋H擴增曲線手動將基線起始循環(huán)數(shù)調(diào)整為指數(shù)增長期之前即可。

【閾值設(shè)置】（以ABI 7500為例）

內(nèi)參閾值設(shè)定：以陽性對照2倍稀釋cDNA定內(nèi)參基因擴增曲線閾值，內(nèi)參基因(Cy5)初始濃度的CT值定為16±3；

TERT閾值設(shè)定：以陽性對照2倍稀釋cDNA定TERT基因擴增曲線閾值，TERT基因(FAM)初始濃度CT值的定為25±3。

【結(jié)果判讀】

圖1 左:陽性293T細胞的擴增曲線；右:陰性MRC-5細胞的擴增曲線

                                             （藍色為TERT基因曲線,黃綠色為內(nèi)參基因曲線）

        1. 陽性對照2倍稀釋后TERT基因Ct值在 25±3，內(nèi)參基因Ct值在16±3，4倍稀釋后TERT基因Ct值               在26±3，內(nèi)參基因Ct值在17±3。

TERT基因和內(nèi)參基因之間?CT維持在9±3，保持穩(wěn)定。

2. 陰性對照經(jīng)2倍、4倍梯度稀釋后，TERT基因Ct值≥35（或檢測不到），內(nèi)參基因Ct值仍在13-20之間，判定為端粒酶活性為陰性。

3. 結(jié)果說明

若待測樣本內(nèi)參基因Ct值在13-19之間，TERT基因Ct值＜35且擴增曲線正常，則樣本端粒酶活性為陽性。

若待測樣本內(nèi)參基因Ct值在13-19之間，TERT基因Ct值≥35且無明顯的擴增曲線則樣本無端粒酶活性。

【說明】

1. 待測樣本cDNA 2倍稀釋作為模板，三次技術(shù)重復(fù)，不設(shè)置梯度稀釋；陽性對照、陰性對照進行2倍、4倍梯度稀釋，建議分別做三重復(fù)；

避免偶然誤差的產(chǎn)生。

2. 如果陽性/陰性對照2倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值＞19，表明參考品有降解或者試劑盒擴增效率下降。

3. 如果所有樣本2倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值＞19，表明試劑盒的擴增效率下降。

4. 如果陽性對照2倍稀釋后TERT基因Ct值＞28，表明TERT基因檢測系統(tǒng)失效。