大鼠骨骼肌細胞模型

      骨骼肌細胞（Skeletal muscle cells）是人和動物體內(nèi)最大的細胞之一，它們是由成肌細胞(Myoblasts)融合而來的多核細胞，故骨骼肌的形成是一個非常復雜的過程，并需要多種細胞信號通路的參與，包括phosphatidylinositol 3-kinase，calcineurin，STAT3和MAPK等。原代骨骼肌細胞的培養(yǎng)是研究細胞分化過程的有效的模型。

骨骼肌細胞大鼠模型

動物品系：SD大鼠

實驗分組：正常對照組、模型組、陽性藥組、受試藥組低、中、高三個劑量組

實驗周期：6~8weeks

建模方法：

1 . 組織取材   SD 大鼠yi醚吸入麻醉后腹腔內(nèi)注射氯an酮(22 mg/kg)。 以左側第 4 肋水平作橫切口, 取胸大肌約 1 cm3 , 并將其修剪成 1 mm3 大小的肌小粒 。反復用Hanks 液洗去血細胞 , 將肌小粒小心貼附于事先用明膠包被的細胞培養(yǎng)瓶底部 , 加入適量成肌細胞增殖培養(yǎng)液(Ham' s F-10 培養(yǎng)基中加入15 %小牛血清、青霉素100 U/ml 、鏈霉素 100 U/ml)。將瓶底向上輕置于37℃、5 %CO2 、飽和濕度的培養(yǎng)箱中, 4 h 后輕輕翻轉培養(yǎng)瓶 , 使肌小粒浸浴于培養(yǎng)液中。 3 d 換液一次 , 待細胞長滿瓶底即可傳代。

2 .成肌細胞的培養(yǎng) 采用組織塊培養(yǎng)法貼塊 2 d 后即可見有細胞從肌小粒邊緣爬出 , 細胞呈梭形, 胞漿透明。1 周后細胞可長滿瓶底的 60 %～ 70 %, 其數(shù)目可達 105 , 此時細胞可呈多角形 , 充分伸展, 部分細胞密集區(qū)可見細胞呈向心性生長 , 相互間排列整齊 , 類似骨骼肌的縱切面。

3 .成肌細胞的分化鑒定  將傳代后的細胞接種至 6 孔板, 加入增殖培養(yǎng)液 , 待細胞長至80 %滿時, 換入成肌細胞誘導分化液(低糖DMEM培養(yǎng)基中加入 2 %馬血清、0 .5%雞胚提取物、青霉0100 U/ml 、鏈霉素 100 U/ml), 換用誘導分化液后細胞可在 3 d 內(nèi)分化 , 融合交織形成肌纖維, 可觀察到收縮現(xiàn)象;并且部分細胞分化形成細長的肌管, 高倍鏡下可見多個核及核分裂象。這些現(xiàn)象為成肌細胞所te有, 可以作為簡便的鑒定方法。

4.成肌細胞的免疫熒光鑒定     

免疫熒光在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；0.5%Triton X-100( PBS配

制 )室溫通透20min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min。水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗（Desmin結蛋白）并放入濕盒，4℃孵育過夜；加熒光二抗：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min。滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。