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基于UHPLC/MSD檢測抗體制劑中游離脂肪酸的含量
研究背景
由于吐溫（聚山梨酯，polysorbate）具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、生物相容性和安全性，是抗體藥物制劑處方中常用的穩(wěn)定劑。作為制劑的重要輔料，吐溫既可以提高活性成分的溶解度，同時又可以抑制蛋白藥物的自動聚合。盡管吐溫在多種生物制劑中被廣泛應用，但由于不同供應商家產品中存在的副產物差異以及其對各種降解反應的敏感性，迫切需要合適的質控方法來監(jiān)控吐溫原料當中以及終端生物制品生命周期中的吐溫質量。
在生物制劑配方的酸堿條件下或者具有脂肪酶/酯酶活性的殘存的宿主細胞蛋白（HCP）的催化作用下，吐溫可能發(fā)生水解，見圖 1。吐溫的降解不僅降低了表面活性劑的真實濃度，而且還與不溶性微粒的形成有關。中藥注射液和化學藥品注射液亦是常用吐溫作為增溶劑、乳化劑或分散劑，制劑通常也會根據主藥的化學性質進行 pH 值的調節(jié)，弱的酸堿條件下同樣會導致吐溫的水解。吐溫原料本身的質量也有較大的差異，同時在長期的儲存和流通中也會產生不同程度的水解。
圖 1. 吐溫 20 水解示意圖
對吐溫原料及其相關的不同類型制劑中的長期穩(wěn)定性和安全性的關注促進了吐溫表征和定量的分析方法的發(fā)展。安捷倫公司與科邁恩以及中國醫(yī)學科學院/協和醫(yī)學院藥物研究所合作建立了吐溫表征和檢測的系列方案，如 UHPLC/QTOF 結合 Polymer Studio 軟件用于吐溫組成和降解產物精細表征，詳細內容可參考往期微信推送。基于游離脂肪酸結構中無明顯發(fā)色基團，并且抗體制劑中游離脂肪酸的含量較低，選擇了靈敏度高、專屬性強并且操作簡單的單四極桿質譜法來檢測游離脂肪酸。安捷倫實驗室應用 ICH Q14 分析方法開發(fā)指導原則的 AQbD（analytical Quality by Design）理念開發(fā)了基于 UHPLC-MSD 單四極桿質譜的游離脂肪酸含量測定方法。
儀器和設備
采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統，配備如下：
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二元泵（部件號 G7120A）
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自動進樣器（部件號 G7167B）
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柱溫箱（部件號 G7116B）
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單四極桿質譜（部件號 G6125C）
色譜柱 Agilent Zorbax SB-C18 2.1 ×50 mm, 1.8 μm
方法開發(fā)與驗證
樣品前處理：操作簡單，進行簡單的蛋白沉淀，離心取上清液過濾后直接進樣分析。
色譜質譜條件摸索：基于 ICH Q14 分析方法開發(fā)指導原則，進行色譜和質譜條件的摸索，如下表所示
3 種游離脂肪酸典型分離色譜圖
方法學驗證結果
分析方法色譜條件確定后，并按照 ICH Q2 的要求進行了方法學驗證。
實際樣品色譜圖與含量
用開發(fā)的方法對三個不同的抗體樣品中的游離脂肪酸進行分析，具體結果如下：
結語
我們基于 ICH Q14 分析方法開發(fā)指導原則的 AQbD 理念，利用 UHPLC/MSD 單四極桿質譜和亞二微米 Zorbax SB-C18 色譜柱開發(fā)了抗體藥物制劑中游離脂肪酸含量測定的方法，并按照藥典要求進行了方法學驗證。本方法樣品基質和流動相無干擾，3 種游離脂肪酸線性相關性良好，相關系數 R2 均大于 0.999，平均回收率處于 86.85%-105.33% 的范圍內，回收結果良好。
本方法能快速準確的檢測抗體制劑中游離脂肪酸的含量，監(jiān)控抗體制劑在運輸、儲存和流通過程中吐溫由于酯酶或則 pH 作用導致的水解變化，為抗體制劑中吐溫降解的研究提供靈敏的檢測結果，同時也可以用于化學藥物注射液、中藥注射液以及吐溫原料中吐溫水解產生的游離脂肪酸的含量，用于評估制劑生命周期中的吐溫的質量。
# 掃碼可獲得詳細的《安捷倫蛋白制劑中可見異物/不溶性微粒整體方案》
參考文獻：
[1] 賈東辰，何伍，中國新藥雜志，2022，31（10）933-936.
[2] Maximilian N. Honemann, Jan Wendler, Tobias Graf, Anja Bathke, Christian H. Bell,
Journal of Chromatography B，1116 (2019) 1–8.