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武漢尚恩生物生產(chǎn)的支原體PCR檢測(cè)試劑盒（巢式PCR）采用巢式PCR法(Nested PCR)以提高支

原體檢測(cè)的靈敏度和和特異性?；驹硎?，先在支原體rRNA上的16S和23S上設(shè)
計(jì)一對(duì)引物，用于擴(kuò)增部分16S-23S之間的保守區(qū)以及全部的其間間隔區(qū)，保守區(qū)
可以用于判斷是否存在支原體污染。

產(chǎn)品名稱	支原體PCR檢測(cè)試劑盒（巢式PCR）
貨號(hào)	SNCD-001
規(guī)格	250次（20ul體系）
簡(jiǎn)介	支原體（Mycoplasma）別名霉形體，直徑0.1-0.3um，具有高度多樣性，是一種沒(méi)有細(xì)胞壁、可以用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小的原核生物。其廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)，大多數(shù)不致病。由于其廣泛存在，外加體積較小可以通過(guò)濾膜混入細(xì)胞培養(yǎng)體系，也很難通過(guò)普通光鏡觀察到，普通抗生素對(duì)其也沒(méi)有有效的抑制作用，因此成為細(xì)胞培養(yǎng)中比較常見(jiàn)而且難以檢測(cè)清除的污染。 支原體污染對(duì)細(xì)胞會(huì)有多方面的影響，包括以下方面：1.細(xì)胞生長(zhǎng)速度改變；2.細(xì)胞形態(tài)、狀態(tài)改變；3.細(xì)胞染色體異常、突變甚至功能改變；4.細(xì)胞對(duì)環(huán)境沖擊耐受力降低；5.相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)異常等?？梢哉f(shuō)對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)有極其嚴(yán)重的影響，因此檢測(cè)及清除廣泛存在的支原體污染成為諸多實(shí)驗(yàn)室必須要經(jīng)歷的過(guò)程。 支原體污染無(wú)法通過(guò)肉眼或者普通光鏡直接判斷，只能通過(guò)各種試劑、儀器檢測(cè)。支原體常規(guī)檢測(cè)方法有：熒光法、培養(yǎng)法、電鏡法、常規(guī)PCR法、一步PCR法、化學(xué)發(fā)光法等，不同檢測(cè)方法能夠檢測(cè)的支原體種類不同，其檢測(cè)靈敏度、特異性、便捷性也有各自的特點(diǎn)。 本公司生產(chǎn)的支原體PCR檢測(cè)試劑盒采用巢式PCR法(Nested PCR)以提高支原體檢測(cè)的靈敏度和和特異性?；驹硎?，先在支原體rRNA上的16S和23S上設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于擴(kuò)增部分16S-23S之間的保守區(qū)以及全部的其間間隔區(qū)，保守區(qū)可以用于判斷是否存在支原體污染，因此初次PCR產(chǎn)物即可初步判定是否存在支原體污染；其次，在23S和間隔區(qū)設(shè)計(jì)第二對(duì)引物，保證第二對(duì)引物目標(biāo)序列在第一對(duì)引物目標(biāo)序列之內(nèi)，形成巢式結(jié)構(gòu)，然后使用第二對(duì)引物對(duì)初次PCR的產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增，可以大大提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。原理圖如下：
使用方法	1.客戶需要自備的試劑、儀器 <1>待檢測(cè)樣品：細(xì)胞上清、血清或者培養(yǎng)基、細(xì)胞DNA。 細(xì)胞上清建議使用培養(yǎng)細(xì)胞3-5天的上清，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短的上清支原體含量較低可能無(wú)法有效檢出，血清或者培養(yǎng)基也應(yīng)在培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)1-2天使支原體有一定程度增殖再用于檢測(cè)；細(xì)胞懸液無(wú)法直接用于檢測(cè)，需要提取總DNA后檢測(cè)，添加量為PCR體系的1/20或更少。 <2>儀器、試劑 a.PCR相關(guān)：PCR儀、無(wú)菌PCR管、微量離心機(jī) b.電泳相關(guān)：瓊脂糖凝膠、電泳儀、電泳緩沖液、DNA marker、DNA染色液 c.通用：移液器、無(wú)菌Tip頭、離心管等 2.實(shí)驗(yàn)步驟 <1>1st PCR a.按以下表格加入各反應(yīng)試劑 b.1st PCR反應(yīng)參數(shù)： STEP1 (起始變性): 94oC 30sec STEP2 (變性): 94oC 30sec STEP3 (退火): 55oC 2min STEP4 (延伸): 72oC 1min STEP5 (循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles STEP6 (最終延伸): 72oC 5min STEP7 (臨時(shí)保存): 4oC forever <2>2nd PCR a.按以下表格加入各反應(yīng)試劑 b.2nd PCR反應(yīng)參數(shù)： STEP1 (起始變性): 94oC 30sec STEP2 (變性): 94oC 30sec STEP3 (退火): 55oC 2min STEP4 (延伸): 72oC 1min STEP5 (循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles STEP6 (最終延伸): 72oC 5min STEP7 (臨時(shí)保存): 4oC forever 3.結(jié)果檢測(cè) <1>取2次PCR產(chǎn)物各10uL，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳并染色觀察目的條帶。由于不同類型的支原體擴(kuò)增出來(lái)的條帶大小不一，因此通過(guò)條帶大小可以粗略判斷支原體類型，如需要進(jìn)一步檢測(cè)確定，建議對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。 <2>結(jié)果示例 2nd產(chǎn)物    1st 產(chǎn)物    Marker
產(chǎn)品組分
存儲(chǔ)條件	-20℃（避免反復(fù)凍融）
保質(zhì)期	-20℃一年（避免反復(fù)凍融）

注意事項(xiàng)：
1.該產(chǎn)品-20度可以保存一年以上，但反復(fù)凍融或保存不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致引物或陽(yáng)性對(duì)照失效，如需多次使用，建議小量分裝。
2.該試劑盒確認(rèn)可以檢測(cè)Mycoplasma arginini 、Mycoplasma arthritidis  等12種支原體，但無(wú)法檢測(cè)人肺炎支原體。
3.該產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于診斷或臨床實(shí)驗(yàn)。