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蜱傳腦炎病毒IGG抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

廣州健侖生物科技有限公司

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【產(chǎn)品名稱】：森林腦炎（蜱傳腦炎）IgG檢測(cè)試劑盒(ELISA)說(shuō)明書(shū)

【預(yù)期用途】

本試劑盒可用于定量檢測(cè)人血清血漿和腦脊髓液中的抗腦炎病毒（TEBV）的IgG抗體，從而控制體液免疫狀態(tài)和確定疫苗接種后的血清轉(zhuǎn)化。鑒別明顯的和潛在的腦炎病毒的感染，通常附帶著抗腦炎病毒的IgM的檢測(cè)。

【臨床背景】

在歐洲，森林腦炎和萊姆病是為常見(jiàn)的蜱媒傳染病。萊姆病分布非常廣泛，但森林腦炎只存在于一些特殊的地方（德國(guó)南部、圖林根州、奧地利、瑞士、匈牙利、瑞典、捷克、斯洛伐克共和國(guó)、克羅地亞、斯洛文尼亞以及一些前蘇聯(lián)地區(qū)等。）。

這兩種病的感染都跟它們的發(fā)育類(lèi)似，包含兩個(gè)或兩個(gè)以上的階段。森林腦炎的病毒血癥階段含有3~14天的孵育階段，在此階段的初期（1-8天） 會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似流行性感冒的癥狀。在大概一周沒(méi)發(fā)熱的間隔后，感染進(jìn)入第二階段，以神經(jīng)系統(tǒng)方面的癥狀強(qiáng)度的改變?yōu)樘卣?，這種階段可能持續(xù)幾周時(shí)間。

在疾病第二階段的初期，通?？梢詸z測(cè)到抗森林腦炎的IgM抗體?？贵w水平在2~6周后達(dá)到峰值。抗體水平要降低到可檢測(cè)以下可能需要10個(gè)月時(shí) 間?？股帜X炎的IgG抗體在IgM抗體出現(xiàn)的同時(shí)或者之后幾天內(nèi)即可檢測(cè)到。感染意味著出現(xiàn)通常能維持一生的免疫力。接種疫苗也能預(yù)防疾病。

腦脊髓液中的森林腦炎特異性抗體可能是在對(duì)森林腦炎抗原進(jìn)行免疫應(yīng)答時(shí)或者之前由血腦屏障的功能紊亂引起的，又或者是局部的免疫應(yīng)答引起的。所以，腦脊髓液中抗體水平的波動(dòng)可能跟這些一般在血清或血漿中的抗體水平不一樣。

由于添加了RF/IgG吸附劑所以RF因子和特異性IgG不會(huì)干涉IgM的檢測(cè)。這兩種檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)合可以用于森林腦炎疫苗接種后的體液免疫隨訪或者感染，早期的森林腦炎感染和監(jiān)測(cè)人血清、血漿和腦脊髓液中的抗體水平。

【檢測(cè)原理】

本試劑盒使用的是兩步法ELISA。微孔中包被了失活的森林腦炎病毒。稀釋后的血清、血漿或者腦脊髓液樣本在微孔中孵育。孵育期間，森林腦炎特 異性抗體會(huì)跟森林腦炎病毒相集合，未結(jié)合的部分通過(guò)洗板洗去。加入酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體會(huì)跟人IgG抗體特異性結(jié)合。加入底物液后 顏色轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，孵育一段時(shí)間后加入終止液終止反應(yīng)，顏色從藍(lán)色轉(zhuǎn)換成黃色，后在酶標(biāo)儀上讀數(shù)。

【儲(chǔ)存和穩(wěn)定性】

此試劑盒在室溫發(fā)貨，儲(chǔ)存在2 – 8℃。避免高溫或太陽(yáng)光直射。樣本和準(zhǔn)備好的試劑的儲(chǔ)存和穩(wěn)定性在相應(yīng)的章節(jié)都有闡明。包被板條在有效期內(nèi)都能保持穩(wěn)定，儲(chǔ)存在2 – 8℃下時(shí)應(yīng)和干燥劑一起密封在小袋中。

【樣本采集和儲(chǔ)存】

血清、血漿或者腦脊髓液

遵守靜脈穿刺的一般規(guī)定，從收集到實(shí)驗(yàn)期間，保存樣本化學(xué)性質(zhì)的完整是非常重要的， 注意不要使用溶血的、脂血、黃疸的樣本，樣本出現(xiàn)渾濁應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)前離心并去除所有的微粒物質(zhì)。
儲(chǔ)存	2~8℃	≤-20℃（小瓶分裝）	避免高溫和陽(yáng)光直射，避免反復(fù)凍融
穩(wěn)定性	5d	12個(gè)月

 

【試劑組成】

數(shù)量	標(biāo)識(shí)	組分
1×12×8	MTP	包被板 即用，可拆分，包被了已滅活的TBE病毒
2×75mL	DILBUF	稀釋緩沖液 即用，紅色
1×0.6mL	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物 藍(lán)色，酶標(biāo)記的抗人IgG抗體
5×0.35mL	CAL 1-5	濃縮校準(zhǔn)品 含人血清，穩(wěn)定劑，防腐劑 濃縮的倍數(shù)以不同的批號(hào)而不同，具體請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽
2×0.35mL	Control LL Control HL	質(zhì)控LL+HL 濃縮 陽(yáng)性質(zhì)控血清，LL“低水平”HL“高水平” 含：人血清，穩(wěn)定劑，防腐劑。 濃縮的倍數(shù)以不同的批號(hào)而不同，具體請(qǐng)參照瓶上的標(biāo)簽
1×100mL	WASHBUF CONC	洗滌液，10倍濃縮 含磷酸鹽緩沖液
2×12mL	TMB SUBS	TMB底物液 即用，含TMB
1×12mL	TMB STOP	TMB終止液 即用，含0.5M 硫酸
2×	FOIL	封板片

【試驗(yàn)需要但試劑盒不提供的設(shè)備】

1.         一次性使用的5;25;50;100;500μl加樣槍頭

2.         漩渦混勻器

3.         樣品稀釋管

4.         軌道振蕩器（200-900rpm）

5.         8道微量移液器和加樣槽。

6.         洗瓶，自動(dòng)化或半自動(dòng)化的洗板機(jī)

7.         450nm的酶標(biāo)儀

8.         雙蒸水或去離子水

9.         紙巾，移液管，計(jì)時(shí)器

 

【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

1.       濃縮試劑的準(zhǔn)備（用于32孔的例子）

稀釋/溶解	組分	加入稀釋液的量	稀釋液	比例	附注	儲(chǔ)存	穩(wěn)定性
80μL	ENZCONJ CONC	8mL	DILBUF	1:101	仔細(xì)混勻	18-25℃	1小時(shí)
10mL	WASHBUF CONC	90mL	蒸餾水	1:10	仔細(xì)混勻	2-8℃	2個(gè)月

2.       標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本的稀釋

	稀釋方法	稀釋液	稀釋比例	備注
CAL 1-5 Control LL Control HL	常規(guī)稀釋	DILBUF	1：101	例子：10μL 校準(zhǔn)品/質(zhì)控品+1000μL
血清、血漿	常規(guī)稀釋	DILBUF	1:101	例子：10μL樣本+1000μL
腦脊髓液	常規(guī)稀釋	DILBUF	1:9	例子：50μL樣本+400μL

用于標(biāo)準(zhǔn)曲線方法需要1~5校準(zhǔn)品和指控血清；樣本所含的濃度如果高于高校準(zhǔn)品濃度需要進(jìn)一步稀釋。用于一點(diǎn)標(biāo)定法則只需要校準(zhǔn)品4和質(zhì)控血清即可。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1.       將200μL已稀釋的校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本加到相應(yīng)的微孔中。

2.       用封板片封板，室溫下（18-25℃）孵育1小時(shí)

3.       揭去封板片，棄去反應(yīng)液，用稀釋后的洗滌液洗板3次（250μL/孔/次），后通過(guò)拍板拍去殘留的液體

4.       將200μL已稀釋的酶聯(lián)物加到每個(gè)孔中

5.       用封板片封板，在室溫下（18-25℃）孵育1小時(shí)

6.       重復(fù)步驟3

7.       將200μL  TMB底物液加到每個(gè)孔中

8.       室溫(18-25℃)孵育30分鐘

9.       按加TMB底物液的順序，將50μL的終止液加到每個(gè)孔中，輕輕混勻

10.   在加入終止液后10分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450nm±10nm處讀數(shù)。

【結(jié)果的計(jì)算】

1.       標(biāo)準(zhǔn)曲線方法

在半對(duì)數(shù)紙上（或者使用自動(dòng)化儀器）以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為Y軸，相應(yīng)的濃度為X軸做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，推薦使用4參數(shù)邏輯函數(shù)（Y=d+(a-b)/(1+(x/c)^b)）。

樣本的濃度應(yīng)當(dāng)直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取，如果有稀釋?zhuān)瑒t在計(jì)算中應(yīng)該乘以稀釋倍數(shù)，如果樣本的濃度過(guò)高，則需要按照實(shí)驗(yàn)前設(shè)置說(shuō)明稀釋樣本。

2.       一點(diǎn)標(biāo)定法

（1）       樣本濃度的手冊(cè)檢測(cè)

需要使用用校準(zhǔn)品4、質(zhì)控血清和樣本各自的平均OD值。校準(zhǔn)品4的OD必須要在的范圍內(nèi)（見(jiàn)一點(diǎn)標(biāo)定法評(píng)估表）。每次檢測(cè)都必須計(jì)算檢測(cè)特殊的校正因子。校準(zhǔn)品4的理論OD值都是按特定批次檢測(cè)得出的（見(jiàn)一點(diǎn)標(biāo)定法評(píng)估表）。將質(zhì)控血清和樣本的OD乘以校正因子：

質(zhì)控血清和樣本濃度可以從批次參考曲線中讀出。

例子：

校準(zhǔn)品4的理論OD值                  OD=1.377

校準(zhǔn)品4的檢測(cè)OD值                  OD=1.273

校正因子F                             F=1.082

樣本的檢測(cè)OD值                      OD=0.937

樣本的校正OD值                      OD=1.014

讀取濃度                         0.5VIEU/mL

（2）       腦脊髓液樣本濃度的計(jì)算（一點(diǎn)標(biāo)定法軟件）

打開(kāi)名為“One Point Calibration TBE IgG Liquor”的Excel文件，將QC證書(shū)的下列指標(biāo)填到Excel中：

校準(zhǔn)品4的理論OD值

校準(zhǔn)品4的OD范圍

臨界1和臨界2的理論OD值

臨界1 OD=灰區(qū)的低點(diǎn)

臨界2 OD=灰區(qū)的高點(diǎn)

填入檢測(cè)到的校準(zhǔn)品4平均OD，將腦脊髓液樣本的鑒別和OD插入到已準(zhǔn)備好的計(jì)算單中。腦脊髓液樣本的求值和OD都會(huì)自動(dòng)完成。

【結(jié)果的判定】

血清/血漿

＜63VIEU/mL         陰性

63-126VIEU/mL       灰區(qū)

＞126VIEU/mL        陽(yáng)性

腦脊髓液

OD＜臨界1理論OD                      陰性

臨界1理論OD＜OD＜臨界2理論OD       灰區(qū)

OD＞臨界2理論OD                      陽(yáng)性

【結(jié)果的說(shuō)明】

1.       疫苗

通過(guò)檢測(cè)血清血漿中的抗TBE的IgG抗體來(lái)證明血清轉(zhuǎn)化

（1）       抗TBE IgG陰性

接種疫苗后無(wú)血清轉(zhuǎn)化

（2）       抗TBE IgG 灰區(qū)

可能有血清轉(zhuǎn)化，建議在2~4周內(nèi)再次檢測(cè)

（3）       抗TBE IgG陽(yáng)性

接種疫苗后有血清轉(zhuǎn)化

2.       感染

（1）       抗TBE IgM和抗TBE IgG 陰性    

無(wú)感染

（2）       抗TBE IgM陰性和TBE IgG 陽(yáng)性  

這可能是潛在的免疫或者是幾周或幾月之前的感染

（3）       抗TBE IgM陽(yáng)性和TBE IgG陰性

可能有新近感染

（4）       抗TBE IgM和抗TBE IgG都陽(yáng)性

有感染