蛋白激酶C (PKC)/鈣離子(Ca2+)響應(yīng)途徑會導(dǎo)致激活T細(xì)胞激活因子的核因子（NFAT）。NFAT由Ca2+和鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的絲A酸磷酸酶鈣調(diào)磷酸酶調(diào)控。在靜息細(xì)胞中，NFAT蛋白被磷酸化并位于細(xì)胞質(zhì)中；受到刺激后，它們會被鈣調(diào)磷酸酶去磷酸化，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并誘導(dǎo)基因表達(dá)。

NFAT報告基因-HEK293細(xì)胞系包含一個在NFAT響應(yīng)元件控制下的螢火蟲熒光素酶基因，該基因被穩(wěn)定整合到HEK293細(xì)胞中。這個細(xì)胞系已經(jīng)驗(yàn)證了對佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和伊諾莫辛的刺激反應(yīng)。

作為BPS Bioscience在中國的區(qū)域總代理，艾美捷科技強(qiáng)烈推薦BPS Bioscience熱銷產(chǎn)品NFAT 報告基因 - HEK293 細(xì)胞系 (PKC/Ca2+ 通路)。產(chǎn)品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

應(yīng)用

? 監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平。

? 篩選PKC/Ca2+途徑的激活劑或抑制劑。

所需但未提供的材料

? PMA（LC Laboratories, #P1680）在DMSO中制備庫存溶液。

? 伊諾莫辛（Sigma, #I3909）在DMSO中制備庫存溶液。

? 檢測培養(yǎng)基：解凍培養(yǎng)基1（無遺傳霉素）

? 生長培養(yǎng)基1B（BPS Cat. #79531）

? 96孔組織培養(yǎng)板或96孔組織培養(yǎng)處理的白色透明底部檢測板

? RO-31-8220（EMD Millipore, #557520）或其他PKC抑制劑

? 用于測量螢火蟲熒光素酶活性的ONE-Step熒光素酶檢測試劑（BPS Bioscience, #60690）。

? 熒光素酶檢測儀

A. NFAT報告基因-HEK293細(xì)胞對TCR交聯(lián)劑的反應(yīng)。

1. 在生長培養(yǎng)基1B中收獲NFAT報告基因-HEK293細(xì)胞，并將細(xì)胞以每孔約30,000個細(xì)胞的密度播種到含有45 ?l檢測培養(yǎng)基的白色透明底部96孔微孔板中。

2. 將板在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（約18-24小時）。

3. 將TCR交聯(lián)劑（PMA與伊諾莫辛）稀釋到檢測培養(yǎng)基中，達(dá)到所需最終濃度的10倍，并每孔加入5 ?l稀釋液。（我們建議從30 nM PMA和1 ?M伊諾莫辛的起始濃度開始。）最終DMSO濃度可高達(dá)0.5%。

向未刺激對照孔中加入相同濃度DMSO但不含交聯(lián)劑的5 ?l檢測培養(yǎng)基。

向無細(xì)胞對照孔中加入含DMSO的50 ?l檢測培養(yǎng)基（用于確定背景發(fā)光）。

每個處理至少設(shè)置三次重復(fù)。

4. 將細(xì)胞在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（約18小時）。

5. 第二天，使用ONE-Step熒光素酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶檢測：

每孔加入50 ?l ONE-Step熒光素酶試劑，并在室溫下?lián)u動約15分鐘。使用熒光素酶檢測儀測量發(fā)光。

6. 數(shù)據(jù)分析：從所有孔的發(fā)光讀數(shù)中減去平均背景發(fā)光（無細(xì)胞對照孔）。

NFAT熒光素酶報告基因表達(dá)的誘導(dǎo)倍數(shù) = 刺激孔的背景減去發(fā)光/未刺激對照孔的平均背景減去發(fā)光。

圖1. NFAT報告基因（熒光素酶）-HEK293細(xì)胞對TCR交聯(lián)劑伊諾莫辛與PMA的反應(yīng)。

B. NFAT報告基因-HEK293細(xì)胞對TCR交聯(lián)劑抑制劑的反應(yīng)。

1. 在生長培養(yǎng)基1B中收獲NFAT報告基因-HEK293細(xì)胞，并將細(xì)胞以每孔約30,000個細(xì)胞的密度播種到含有45 ?l檢測培養(yǎng)基的白色透明底部96孔微孔板中。

2. 將板在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（約18-24小時）。

3. 將抑制劑（RO-31-8220）稀釋到檢測培養(yǎng)基中，達(dá)到所需最終濃度的10倍，并每孔加入5 ?l稀釋液。最終DMSO濃度可高達(dá)0.5%。

向未抑制對照孔中加入相同濃度DMSO但不含抑制劑的5 ?l檢測培養(yǎng)基。

4. 將TCR交聯(lián)劑（PMA與伊諾莫辛）稀釋到檢測培養(yǎng)基中，達(dá)到所需最終濃度的10倍（我們建議從30 nM PMA和1 ?M伊諾莫辛的起始濃度開始）并每孔加入5 ?l稀釋液。最終DMSO濃度可高達(dá)0.5%。

向未刺激對照孔中加入相同濃度DMSO但不含交聯(lián)劑的5 ?l檢測培養(yǎng)基。

向無細(xì)胞對照孔中加入含DMSO的55 ?l檢測培養(yǎng)基（用于確定背景發(fā)光）。

每個處理至少設(shè)置三次重復(fù)。

5. 將細(xì)胞在37°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（約18小時）。

第二天，使用ONE-Step熒光素酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶檢測：

每孔加入55 ?l One-Step熒光素酶試劑，并在室溫下?lián)u動約15分鐘。使用熒光素酶檢測儀測量發(fā)光。

6. 數(shù)據(jù)分析：從所有孔的發(fā)光讀數(shù)中減去平均背景發(fā)光（無細(xì)胞對照孔）。

通過將每種條件除以刺激孔的背景減去發(fā)光來計算NFAT熒光素酶報告基因表達(dá)的百分比。在沒有RO-31-8220的情況下，用1 ?M伊諾莫辛和30 nM PMA刺激的細(xì)胞的背景減去發(fā)光被設(shè)為100%。

圖2. RO-31-8220抑制PKC在PMA和伊諾莫辛誘導(dǎo)的NFAT報告基因（熒光素酶）-HEK293細(xì)胞中的作用。

結(jié)果以發(fā)光百分比顯示。在沒有RO31-8220的情況下，用1 ?M伊諾莫辛和30 nM PMA刺激的細(xì)胞的背景減去發(fā)光被設(shè)為100%。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認(rèn)證的生命科學(xué)領(lǐng)域的供應(yīng)商，公司一直致力于開發(fā)藥物研發(fā)領(lǐng)域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創(chuàng)立，從創(chuàng)立至今一直致力于提供藥物研發(fā)領(lǐng)域的創(chuàng)新解決方案，以推動新的藥物發(fā)現(xiàn)。公司主要關(guān)注的領(lǐng)域包括免疫療法、表觀遺傳學(xué)、CRISPR、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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NFAT報告基因-HEK293細(xì)胞系NFAT報告基因-HEK293細(xì)胞系