布魯氏菌IgM抗體（Brucella Ab IgM）試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗法）使用說明書

僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人布魯氏菌IgM抗體（Brucella Ab IgM）的含量。

l有效期：6個月

l保存條件：2-8℃

[實驗原理]

試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人布魯氏菌IgM抗體（Brucella Ab IgM）捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人布魯氏菌IgM抗體（Brucella Ab IgM）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

[樣本處理及要求]

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組*剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標本溶血會影響檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

[需要而未提供的試劑和器材]

1.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

4.蒸餾水或去離子水

[試劑盒組成]

備注：

1. 標準品濃度依次為：100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/ml

2. 經(jīng)過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時，可用樣本*釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。

[注意事項]

1.嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2.洗板不正確可以導(dǎo)致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4.底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。

6.在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7.平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8.任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

9.不能使用過期產(chǎn)品。

10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

[試劑準備]

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

[操作步驟]

1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3. 樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

[實驗結(jié)果計算]

以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關(guān)軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

[試劑盒性能]

1. 檢測范圍：3.125 ng/ml – 100 ng/ml。

2. 靈敏度：*低檢測濃度小于0.1 ng/ml。

3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。

布魯氏桿菌，一種革蘭氏陰性的不運動細菌，自被發(fā)現(xiàn)以來，便因其強大的生存能力和廣泛的傳播性而受到全球的關(guān)注。該細菌無莢膜，觸酶、氧化酶陽性，絕對嗜氧，可在多種家畜體內(nèi)存活，是引起布魯氏桿菌病的主要病原體。布魯氏桿菌病，簡稱布病，是一種人畜共患的慢性傳染性疾病，嚴重危害著畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康。

布魯氏桿菌在土壤、水中和皮毛上能存活數(shù)周至數(shù)月，甚至在食品中也能生存約兩個月。這種頑強的生命力使得布魯氏桿菌能夠在各種環(huán)境中存活，增加了其傳播的風(fēng)險。在我國，牛、羊、豬是布魯氏桿菌病的主要傳染源，其中羊型布魯氏桿菌對人體的傳播性*強，致病率最高，危害最為嚴重。

布魯氏桿菌的傳播途徑多樣，主要包括經(jīng)皮膚、黏膜接觸傳播，直接接觸病畜或其排泄物、陰道分泌物等，也可通過消化道和呼吸道傳染。人類主要通過直接接觸病畜或其排泄物，或者食用未加工熟的病畜的肉類及其奶制品而感染。感染后，患者可能會出現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)疼痛、肝脾腫大等癥狀，甚至可能導(dǎo)致神經(jīng)痛、體重下降、厭食等嚴重不良癥狀。

預(yù)防布魯氏桿菌病的發(fā)生也至關(guān)重要。預(yù)防措施包括加強家畜飼養(yǎng)管理，定期接種疫苗，避免接觸病畜和污染的環(huán)境，以及注意個人衛(wèi)生，做到飯前便后洗手，避免交叉感染。

此外，隨著全球氣候變暖、生態(tài)環(huán)境變化等問題的加劇，布魯氏桿菌的生存和傳播環(huán)境可能會發(fā)生變化，其傳播風(fēng)險可能會進一步增加?？偟膩碚f，布魯氏桿菌是一種危害嚴重的病原體，其傳播廣泛，危害大。我們需要在預(yù)防、治療和研究等方面加強工作，以保障人類和動物的健康，促進畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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