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滯留抑菌效果鑒定試驗
1 原 理
本試驗通過模擬適合細菌生長、繁殖和可能產(chǎn)生感染的皮膚條件下，使用隨機性、雙盲的、配對比較的方法，檢測抗（抑）菌樣品12h或24h的滯留抑菌效果。
2 實驗器材
（1）試驗產(chǎn)品 試驗品為25套按順序編號的樣品。每套2塊，一塊為測試樣品皂，另一塊為不含抗（抑）菌劑的對照樣品
（2）不含抑菌劑的洗發(fā)液和沐浴液各25瓶（200mL/瓶，試驗調(diào)整階段用）
（3）不含抑菌劑的香皂 25塊（試驗調(diào)整階段用）
（4）胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）
（5）胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）
（6）0.075mol/L的磷酸鹽緩沖液
（7）70%酒精
（8）恒溫培養(yǎng)箱
（9）金屬筒 （直徑2.2cm、高度3cm）
（10）一次性接種環(huán)（直徑4mm）
（11）小塑料碗（直徑2.2cm、高2.5mm）
（12）膠帶（Darapore，3M公司生產(chǎn)）
（13）尼龍刮菌棒
（14）Triton-X 100 500ml
（15）外用抗生素軟膏（例如：百多邦莫匹羅星軟膏）
（16）玻璃彎棒
（17）羊血 經(jīng)脫纖維處理
（18）金黃色葡萄球菌ATCC 27217（此株金黃色葡萄球菌是一種低毒性、對青霉素敏感、對四環(huán)素有抗藥性的色素株，曾用于許多試驗研究，沒有任何嚴重副作用）。
（19）皮膚消毒劑
3 試驗步驟
（1）調(diào)整階段
試驗開始前 7d至 14d， 志愿者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗發(fā)水和沐浴液進行日常的洗手、洗澡。此階段持續(xù)至少 7d，但不超過 14d。
（2）清洗階段
清洗階段共 3d，志愿者每天用抗（抑）菌樣品清洗一側(cè)前臂， 用對照樣品清洗另一側(cè)前臂，清洗過程如下：
1）先清洗左臂，用流動水（水溫應保持在 35℃～37℃）打濕前臂內(nèi)側(cè)；
2） 用香皂從手腕至臂肘上下摩擦15s；
3）用手在涂有香皂的手臂上上下摩擦泡沫45s；
4）用流動的清水沖洗前臂15s， 不要搓擦；
5）用紙巾沾干前臂. 不要搓擦；
6）重復以上步驟清洗右臂；
7）按上面所描述的試驗步驟每日清洗前臂3次，每次間隔至少一個小時，在zui后一次清洗之后，需記錄好時間，在 12h之后，進行滯留效果檢測。在第9次清洗前臂以后，志愿者不能洗澡、淋浴或洗凈前臂，直到試驗結(jié)束。清洗前后的兩塊香皂的重量及志愿者完成清洗的情況，須記錄下來。
（3）試驗階段
清洗階段的第四天（zui后一次清洗后 12h或24h），將在志愿者每只前臂上劃出一個試驗區(qū)，對試驗區(qū)進行接種、封包和回收存活細菌，具體步驟如下:
1）將金黃色葡萄球菌（ATCC 27217）連續(xù)轉(zhuǎn)種3代，取第3代培養(yǎng)物接種于胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）中，在 35℃±2℃ 的條件下培養(yǎng) 20h ±2h。然后用胰蛋白酶大豆肉湯適當稀釋菌懸液，使菌懸液濃度約為 108cfu/mL～109cfu/mL。
2）細菌接種：在志愿者的每只前臂中間部位（不要在手腕和肘皺褶處），用帶有印墨直徑為3.00cm的玻璃量筒扣在皮膚上，劃分出一個試驗區(qū)。使用加樣器取10μL上述菌懸液，接種于前臂試驗區(qū)（菌落數(shù)為106cfu/試驗區(qū)～107cfu/試驗區(qū)），用一次性接種環(huán)，把接種物涂成一圓形，使其與試驗區(qū)邊緣應有 4mm～5mm的距離。
3）封包：細菌接種后立即用小塑料碗扣于染菌區(qū)上面 ，再用膠帶將小塑料碗固定在皮膚上，記錄封包的時間。
4）回收存活細菌：接種后 2h±5min 對前臂上接種的區(qū)域進行取樣。將金屬筒放置于試驗區(qū)中間部位，不要接觸到蓋有印墨的邊緣。將 1mL 含0.1% triton-X100的0.075mol/L磷酸鹽緩沖液吸移至金屬筒內(nèi)，用尼龍刮菌棒刮洗金屬筒罩住區(qū)域內(nèi)的皮膚 60s，將筒內(nèi)液體吸移至試管內(nèi)，再加 1mL 含0.1%triton X-100的 0.075mol/L磷酸鹽緩沖液，對該區(qū)域內(nèi)的皮膚進行第二次刮洗 30s，將第二次擦洗的液體，注入含*次刮洗液體的試管中。
5）實驗區(qū)試驗后的消毒處理: 一個實驗區(qū)采樣之后，需用70% 的酒精對實驗區(qū)進行消毒。然后對另一個實驗區(qū)以同樣方法進行采樣， 采樣結(jié)束后，先用70% 的酒精對實驗區(qū)進行消毒，然后用皮膚消毒劑對兩只前臂進行消毒處理，處理后清水沖洗，擦干，再涂少量的抗生素軟膏。
6）平皿接種與培養(yǎng):對每一個取樣進行平皿接種，以 0.0375mol/L磷酸鹽緩沖液對樣品進行10倍系列稀釋，選適當稀釋度取 0.1mL 接種于2個含5% 羊血的TSA平板表面，用玻璃彎棒涂勻，在 35℃±2℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h±4h，計數(shù)菌落數(shù)。
7）以試驗同批次的稀釋液、培養(yǎng)基等分別設(shè)陰性對照。 8）抑菌率的計算
抑菌率=[ （對照平均菌落數(shù)－試驗平均菌落數(shù)）/ 對照平均菌落數(shù)] ×100%
4 評價規(guī)定
（1）各次試驗陰性對照菌無菌生長。
（2）實驗不得少于16人次，抑菌率均≥ 50%，判定該產(chǎn)品在規(guī)定的時間內(nèi)有滯留抑菌作用。
5 注意事項
（1）志愿者錄用標準
1）年齡介于18歲至65歲的男性或女性；
2）志愿者應身體健康；
3）前臂應完好無損且沒有皮膚病及其它皮膚問題；
4）同意在整個試驗期間，避免使用抗（抑）菌洗液和乳膏、局部類固醇類藥和全身或局部使用抗生素，除非因為并發(fā)病癥醫(yī)生要求使用；
5）同意在清洗階段使用非藥物香皂或洗液洗澡和淋浴，但志愿者不能清洗前臂。在第9次洗完前臂以后，不洗澡，淋浴或洗凈前臂，直到試驗結(jié)束。
（2）排除志愿者的標準 如果志愿者有下列情況之一，不能被錄用參加試驗
1）同時參加另外一個臨床試驗
2）在過去的 14d中，參加過任何一種形式的關(guān)于清潔手或手臂的試驗
3）對香皂、去污劑、香水或青霉素過敏
4）懷孕婦女
5）診斷患有糖尿病、肝炎、艾滋?。℉IV陽性）等
（3）其它試驗限制
1）志愿者不得使用其它清潔用品；
2）志愿者應避免洗熱水盆浴和游泳；
3）志愿者應避免接觸未干的油漆、涂料或者其它溶劑；
4）志愿者應避免在手腕處和前臂上噴灑香水。
（4）在試驗完成后的 48h～72h內(nèi)，需檢查前臂上有無小膿皰、水皰，隆起的紅色癢皰。出現(xiàn)這些情況的志愿者應盡快通知檢驗單位。