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離子色譜/脈沖安培法測(cè)定奶粉中低聚果糖含量
摘要：本文建立了測(cè)定奶粉中的低聚果糖含量的離子色譜方法。該方法以 Hamilton RCX-30 - 250/4.6 為色譜柱，氫氧化鈉和醋酸鈉為流動(dòng)相梯度洗脫，采用脈沖安培法進(jìn)行檢測(cè)。果糖在 0.08 mg/L～35 mg/L 濃度范圍內(nèi)顯示了良好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率在 90%左右。采用電化學(xué)檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單快速、高靈敏、抗干擾的分析方法。
關(guān)鍵詞：離子色譜法；低聚果糖；奶粉; 脈沖安培檢測(cè)
1. 引言
低聚果糖又稱蔗果低聚糖，是由 1～3 個(gè)果糖基通過(guò) β(2—1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物[1]。低聚果糖是一種天然活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)腸道菌群，增殖雙歧桿菌，促進(jìn)鈣的吸收，調(diào)節(jié)血脂，免疫調(diào)節(jié)，抗齲齒等保健功能 [2]。作為添加雙歧因子（低聚半乳糖，低聚果糖）,低聚果糖常添加于奶粉中以增強(qiáng)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)功能。目前在寡糖類物質(zhì)的分析方面，主要有三類方法：酶學(xué)法、化學(xué)法和色譜法。酶學(xué)法具有非常靈敏和高特異性等特點(diǎn)，但容易受樣品中污染物干擾，并且酶的來(lái)源和純化也有困難?；瘜W(xué)法在分析糖類物質(zhì)時(shí)只能測(cè)定出總糖和還原糖的含量。色譜法則可將各種低聚糖相互分離和分別定量，常用于糖分析的色譜方法有氣相色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法等[3]。離子色譜分離結(jié)合脈沖安培檢測(cè)是目前糖分析的理想方法，該方法基于糖在堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進(jìn)行分離[4-6]，方法抗干擾性強(qiáng)，靈敏度高。
2. 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
Metrohm 850 離子色譜儀；858 自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)；安培檢測(cè)器，配有金工作電極和鈀參比電極；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：MagIC Net 2.3 Professional。氫氧化鈉溶液（50–52%，F(xiàn)luka 72064）；NaAc(優(yōu)級(jí)純,Sigma 71183)；果糖（98%,分析純）；馬來(lái)酸（C4H4O4，分析純）；硼氫化鈉（NaBH4，分析純）；冰乙酸（CH3COOH，分析純）；三水乙酸鈉（CH3COONa•3H2O，分析純）；菊粉(低聚果糖含量 96.3%)；低聚果糖試劑盒：蔗糖混合酶（其中蔗糖酶 100U，β -淀粉酶 500 U，支鏈淀粉酶 100U，麥芽糖酶 1000U）；果聚糖混合酶（外切 1000U，內(nèi)切 100U）：其中果糖和蔗糖的含量均不超過(guò) 0.005%， Megazyme；超純水（電阻率>18 MΩ·cm，25 °C)。 2.2 試劑配制馬來(lái)酸鈉緩沖溶液（100mmol/L，pH6.5）：稱取 1.16g 馬來(lái)酸于 150mL 燒杯中，加入約 70mL 水溶解，用 1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 值 6.5，用水稀釋至 100mL。4℃保存，可放置 3 個(gè)月蔗糖混合酶溶液（蔗糖酶約 4.5U/mL，β-淀粉酶約 23U/mL，支鏈淀粉酶約 4.5U/mL，麥芽糖酶約 45U/mL）：將 1 瓶蔗糖復(fù)合酶溶解在 22mL 馬來(lái)酸鈉緩沖溶液，分裝到 2mL 的聚丙烯的試管中，-20℃保存，可放置 6 個(gè)月。氫氧化鈉溶液（50mmol/L）：稱取 2g 氫氧化鈉（至 0.1g），溶于水溶解并用水稀釋至 1000mL。硼氫化鈉溶液（10mg/mL）：稱取 50mg 硼氫化鈉于聚丙烯試管中，用 50mmol/L 氫氧化鈉溶液溶解，zui終濃度為 10mg/mL，用時(shí)現(xiàn)配。乙酸溶液（0.2mol/L）：吸取 0.6mL 冰乙酸，用水稀釋至 50mL。乙酸鈉溶液（0.2mol/L）：稱取 1.36 三水乙酸鈉（至 0.01g），溶于水溶解并用水稀釋至 50mL。乙酸鈉緩沖溶液：吸取 14mL 乙酸溶液和 11mL 乙酸鈉溶液混合，并用水稀釋至 50mL。果聚糖混合酶溶液（約外切 45.5U/mL，內(nèi)切 4.55U/mL）：將 1 瓶果聚糖混合酶溶解在 22mL 乙酸鈉緩沖溶液，分裝到 2mL 的聚丙烯的試管中，-20℃保存，可放置 6 個(gè)月。果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取果糖 0.0110g，，用超純水定容到 50ml，制得果糖 215.6 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋得到濃度為 0.086，0.172，0.431，0.862，1.725，3.450，8.624，17.248，34.496mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。 2.3 樣品制備將奶粉混勻，準(zhǔn)確稱取奶粉 S1-2 約 1.2g，奶粉 S1-3 約 1.0g（至 0.1mg，至少含有低聚果糖 20mg）于 150mL 燒杯中，加入 80℃熱水約 50mL，置于 80℃恒溫水浴振蕩器中，振搖 15min 后，取出，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至 100mL 容量瓶中，用水分三次沖洗燒杯，用水定容，搖勻，溶液經(jīng)濾紙過(guò)濾，取 500μL 上清液于 25mL 容量瓶中，加入 1000μL 蔗糖酶溶液，搖勻，置于 40℃水浴中，每隔 10min 振搖 10s，酶解 60min 后，加入 500μL 硼氫化鈉溶液，搖勻，置于 40℃水浴中，每隔 10min 振搖 10s，反應(yīng) 30min 后，取出，冷卻至室溫，加入 1.25mL 0.2mol/L 乙酸溶液，搖勻，靜置 10min，加入 250μL 果聚糖酶，搖勻，置于 40℃ 水浴中，每隔 10min 振搖 10s，反應(yīng) 30min 后，取出，冷卻至室溫。用水定容至刻度線，樣液依次通過(guò) 0.45μm 水相濾膜和 RP 柱，棄去前面 6mL，收集后面洗脫液待測(cè)。準(zhǔn)確稱取菊粉 1.6g，溶解并定容在 100ml 容量瓶中，回收率實(shí)驗(yàn)時(shí)在稱好的樣品中添加菊粉(1ml 相當(dāng)于果糖 2.505mg/L)，其它步驟相同，與樣品一起處理。 2.4 色譜條件色譜柱：Hamilton RCX-30 - 250/4.6；淋洗液采用高壓梯度模式：NaOH 90 mmol/L (0-22min)；NaOH 150 mmol/L+ 500 mmol/L NaAc(22-35min)；NaOH 90 mmol/L (35-60min)。流速：1.0 mL/min；柱溫：32℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)方式：脈沖安培法檢測(cè)，檢測(cè)溫度： 35℃。檢測(cè)波形參數(shù)：E1=0.05 V；E2=0.55 V； E3=-0.1 V；t1=300 ms； t2=50 ms；t3=200 ms。
3. 結(jié)果與討論
3.1 色譜條件選擇
離子色譜法測(cè)定糖類物質(zhì)是通過(guò)將其在堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進(jìn)行分離，本文選用 Hamilton RCX-30 - 250/4.6 色譜柱，對(duì)于果糖與其余單雙糖的分離效果良好。大部分添加低聚果糖的食品中會(huì)含有一些單雙糖，同時(shí)前處理過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生葡萄糖等單糖，而這些單雙糖也會(huì)影響到低聚果糖的分離，因此在試驗(yàn)中必須使用梯度洗脫程序，既能達(dá)到較好的分離，也能使分析時(shí)間縮短。
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限
在 2.4 色譜條件下，將不同濃度果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣分析，以被測(cè)糖的質(zhì)量濃度 Q( mg /L) 對(duì)相應(yīng)的峰面積 A 作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到線性方程為 A=1.12752+1.94065，線性相關(guān)系數(shù)為 0.9994，線性范圍可達(dá)到 4 個(gè)數(shù)量級(jí)，按照 3 倍信噪比計(jì)算檢出限為 0.0694mg/L。
3.3 樣品分析
本文對(duì)兩種奶粉樣品進(jìn)行了分析，實(shí)際色譜分析的是樣品處理后的果糖含量，結(jié)果計(jì)算時(shí)果糖與低聚果糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)為 1.23，得到檢測(cè)值分別為 3.25%和 5.73%，與標(biāo)示值接近，表明此方法可行性好。圖 1 是奶粉樣品溶液色譜圖。圖 1 奶粉 S1-2 色譜圖選用奶粉樣品 S1-2，精密稱定，并分別加入高、中、低 3 種濃度的菊粉溶液，充分混勻，按照本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行前處理后測(cè)定，平行測(cè)定 6 份，平均回收率均在 90%以上，結(jié)果見(jiàn)表 1. 表 1 奶粉 S1-2 回收率與精密度測(cè)定結(jié)果樣品名稱 樣品含量(mg/L) 加標(biāo)量(mg/L) 平均回收率（%）， n=6 RSD% S1-2 6.36 2.505 96.49 0.34 5.010 93.01 2.12 7.515 91.71 0.89
4. 結(jié)論
本文采用離子色譜分離，脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定了奶粉中的低聚果糖，采用優(yōu)化的梯度洗脫程序，有效分離了葡萄糖、果糖和蔗糖。該方法靈敏度高，線性范圍寬，有較好的精密度和準(zhǔn)確度，可用于奶粉等食品樣品中低聚果糖含量的日常分析。
參考文獻(xiàn)
[1] 陳亞非，羅琪珊，葛亞中。低聚果糖調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能作用的進(jìn)展[J]?，F(xiàn)代食品科技，2003，21（4）： 83-87
[2]楊正梅，卜友泉，何瑞國(guó)。低聚果糖的生物學(xué)效應(yīng)及其安全性研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2004，8（4）： 122-126
[3]劉修鵬。離子色譜法測(cè)定食品中低聚果糖和飲用水中 F -、Cl-、NO3 -和 SO4 2-的研究[D].碩士學(xué)位論文，2007.
[4]王美菡，李敏，郭健，劉修鵬。離子交換色譜法測(cè)定保健食品中低聚果糖含量[J]。中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2007，17（6）：961-963
[5]張績(jī)覓，劉玉峰，唐華澄，李東。離子色譜法測(cè)定食品中低聚果糖的含量[J].。食品研究與開(kāi)發(fā)，2012， 33(1):135-138
[6]AOAC Official Method 997.08. Fructans in food products ion exchangechromatographic method[EB]
關(guān)鍵詞：離子色譜法；低聚果糖；奶粉; 脈沖安培檢測(cè)
1. 引言
低聚果糖又稱蔗果低聚糖，是由 1～3 個(gè)果糖基通過(guò) β(2—1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物[1]。低聚果糖是一種天然活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)腸道菌群，增殖雙歧桿菌，促進(jìn)鈣的吸收，調(diào)節(jié)血脂，免疫調(diào)節(jié)，抗齲齒等保健功能 [2]。作為添加雙歧因子（低聚半乳糖，低聚果糖）,低聚果糖常添加于奶粉中以增強(qiáng)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)功能。目前在寡糖類物質(zhì)的分析方面，主要有三類方法：酶學(xué)法、化學(xué)法和色譜法。酶學(xué)法具有非常靈敏和高特異性等特點(diǎn)，但容易受樣品中污染物干擾，并且酶的來(lái)源和純化也有困難?；瘜W(xué)法在分析糖類物質(zhì)時(shí)只能測(cè)定出總糖和還原糖的含量。色譜法則可將各種低聚糖相互分離和分別定量，常用于糖分析的色譜方法有氣相色譜法、液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用、毛細(xì)管電泳法、離子色譜法等[3]。離子色譜分離結(jié)合脈沖安培檢測(cè)是目前糖分析的理想方法，該方法基于糖在堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進(jìn)行分離[4-6]，方法抗干擾性強(qiáng)，靈敏度高。
2. 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
Metrohm 850 離子色譜儀；858 自動(dòng)樣品處理系統(tǒng)；安培檢測(cè)器，配有金工作電極和鈀參比電極；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：MagIC Net 2.3 Professional。氫氧化鈉溶液（50–52%，F(xiàn)luka 72064）；NaAc(優(yōu)級(jí)純,Sigma 71183)；果糖（98%,分析純）；馬來(lái)酸（C4H4O4，分析純）；硼氫化鈉（NaBH4，分析純）；冰乙酸（CH3COOH，分析純）；三水乙酸鈉（CH3COONa•3H2O，分析純）；菊粉(低聚果糖含量 96.3%)；低聚果糖試劑盒：蔗糖混合酶（其中蔗糖酶 100U，β -淀粉酶 500 U，支鏈淀粉酶 100U，麥芽糖酶 1000U）；果聚糖混合酶（外切 1000U，內(nèi)切 100U）：其中果糖和蔗糖的含量均不超過(guò) 0.005%， Megazyme；超純水（電阻率>18 MΩ·cm，25 °C)。 2.2 試劑配制馬來(lái)酸鈉緩沖溶液（100mmol/L，pH6.5）：稱取 1.16g 馬來(lái)酸于 150mL 燒杯中，加入約 70mL 水溶解，用 1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 值 6.5，用水稀釋至 100mL。4℃保存，可放置 3 個(gè)月蔗糖混合酶溶液（蔗糖酶約 4.5U/mL，β-淀粉酶約 23U/mL，支鏈淀粉酶約 4.5U/mL，麥芽糖酶約 45U/mL）：將 1 瓶蔗糖復(fù)合酶溶解在 22mL 馬來(lái)酸鈉緩沖溶液，分裝到 2mL 的聚丙烯的試管中，-20℃保存，可放置 6 個(gè)月。氫氧化鈉溶液（50mmol/L）：稱取 2g 氫氧化鈉（至 0.1g），溶于水溶解并用水稀釋至 1000mL。硼氫化鈉溶液（10mg/mL）：稱取 50mg 硼氫化鈉于聚丙烯試管中，用 50mmol/L 氫氧化鈉溶液溶解，zui終濃度為 10mg/mL，用時(shí)現(xiàn)配。乙酸溶液（0.2mol/L）：吸取 0.6mL 冰乙酸，用水稀釋至 50mL。乙酸鈉溶液（0.2mol/L）：稱取 1.36 三水乙酸鈉（至 0.01g），溶于水溶解并用水稀釋至 50mL。乙酸鈉緩沖溶液：吸取 14mL 乙酸溶液和 11mL 乙酸鈉溶液混合，并用水稀釋至 50mL。果聚糖混合酶溶液（約外切 45.5U/mL，內(nèi)切 4.55U/mL）：將 1 瓶果聚糖混合酶溶解在 22mL 乙酸鈉緩沖溶液，分裝到 2mL 的聚丙烯的試管中，-20℃保存，可放置 6 個(gè)月。果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取果糖 0.0110g，，用超純水定容到 50ml，制得果糖 215.6 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋得到濃度為 0.086，0.172，0.431，0.862，1.725，3.450，8.624，17.248，34.496mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。 2.3 樣品制備將奶粉混勻，準(zhǔn)確稱取奶粉 S1-2 約 1.2g，奶粉 S1-3 約 1.0g（至 0.1mg，至少含有低聚果糖 20mg）于 150mL 燒杯中，加入 80℃熱水約 50mL，置于 80℃恒溫水浴振蕩器中，振搖 15min 后，取出，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至 100mL 容量瓶中，用水分三次沖洗燒杯，用水定容，搖勻，溶液經(jīng)濾紙過(guò)濾，取 500μL 上清液于 25mL 容量瓶中，加入 1000μL 蔗糖酶溶液，搖勻，置于 40℃水浴中，每隔 10min 振搖 10s，酶解 60min 后，加入 500μL 硼氫化鈉溶液，搖勻，置于 40℃水浴中，每隔 10min 振搖 10s，反應(yīng) 30min 后，取出，冷卻至室溫，加入 1.25mL 0.2mol/L 乙酸溶液，搖勻，靜置 10min，加入 250μL 果聚糖酶，搖勻，置于 40℃ 水浴中，每隔 10min 振搖 10s，反應(yīng) 30min 后，取出，冷卻至室溫。用水定容至刻度線，樣液依次通過(guò) 0.45μm 水相濾膜和 RP 柱，棄去前面 6mL，收集后面洗脫液待測(cè)。準(zhǔn)確稱取菊粉 1.6g，溶解并定容在 100ml 容量瓶中，回收率實(shí)驗(yàn)時(shí)在稱好的樣品中添加菊粉(1ml 相當(dāng)于果糖 2.505mg/L)，其它步驟相同，與樣品一起處理。 2.4 色譜條件色譜柱：Hamilton RCX-30 - 250/4.6；淋洗液采用高壓梯度模式：NaOH 90 mmol/L (0-22min)；NaOH 150 mmol/L+ 500 mmol/L NaAc(22-35min)；NaOH 90 mmol/L (35-60min)。流速：1.0 mL/min；柱溫：32℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)方式：脈沖安培法檢測(cè)，檢測(cè)溫度： 35℃。檢測(cè)波形參數(shù)：E1=0.05 V；E2=0.55 V； E3=-0.1 V；t1=300 ms； t2=50 ms；t3=200 ms。
3. 結(jié)果與討論
3.1 色譜條件選擇
離子色譜法測(cè)定糖類物質(zhì)是通過(guò)將其在堿性淋洗液中離子化后在陰離子交換柱上進(jìn)行分離，本文選用 Hamilton RCX-30 - 250/4.6 色譜柱，對(duì)于果糖與其余單雙糖的分離效果良好。大部分添加低聚果糖的食品中會(huì)含有一些單雙糖，同時(shí)前處理過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生葡萄糖等單糖，而這些單雙糖也會(huì)影響到低聚果糖的分離，因此在試驗(yàn)中必須使用梯度洗脫程序，既能達(dá)到較好的分離，也能使分析時(shí)間縮短。
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限
在 2.4 色譜條件下，將不同濃度果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)樣分析，以被測(cè)糖的質(zhì)量濃度 Q( mg /L) 對(duì)相應(yīng)的峰面積 A 作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到線性方程為 A=1.12752+1.94065，線性相關(guān)系數(shù)為 0.9994，線性范圍可達(dá)到 4 個(gè)數(shù)量級(jí)，按照 3 倍信噪比計(jì)算檢出限為 0.0694mg/L。
3.3 樣品分析
本文對(duì)兩種奶粉樣品進(jìn)行了分析，實(shí)際色譜分析的是樣品處理后的果糖含量，結(jié)果計(jì)算時(shí)果糖與低聚果糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)為 1.23，得到檢測(cè)值分別為 3.25%和 5.73%，與標(biāo)示值接近，表明此方法可行性好。圖 1 是奶粉樣品溶液色譜圖。圖 1 奶粉 S1-2 色譜圖選用奶粉樣品 S1-2，精密稱定，并分別加入高、中、低 3 種濃度的菊粉溶液，充分混勻，按照本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行前處理后測(cè)定，平行測(cè)定 6 份，平均回收率均在 90%以上，結(jié)果見(jiàn)表 1. 表 1 奶粉 S1-2 回收率與精密度測(cè)定結(jié)果樣品名稱 樣品含量(mg/L) 加標(biāo)量(mg/L) 平均回收率（%）， n=6 RSD% S1-2 6.36 2.505 96.49 0.34 5.010 93.01 2.12 7.515 91.71 0.89
4. 結(jié)論
本文采用離子色譜分離，脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定了奶粉中的低聚果糖，采用優(yōu)化的梯度洗脫程序，有效分離了葡萄糖、果糖和蔗糖。該方法靈敏度高，線性范圍寬，有較好的精密度和準(zhǔn)確度，可用于奶粉等食品樣品中低聚果糖含量的日常分析。
參考文獻(xiàn)
[1] 陳亞非，羅琪珊，葛亞中。低聚果糖調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能作用的進(jìn)展[J]?，F(xiàn)代食品科技，2003，21（4）： 83-87
[2]楊正梅，卜友泉，何瑞國(guó)。低聚果糖的生物學(xué)效應(yīng)及其安全性研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2004，8（4）： 122-126
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[6]AOAC Official Method 997.08. Fructans in food products ion exchangechromatographic method[EB]