組織單細(xì)胞懸液的制備

（全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境）

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剪碎法：

將組織塊放入平皿后，加入少量PBS+10%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入10 ml PBS+10%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用100 目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾到試管內(nèi)；離心沉淀1500 rpm×3 min，再用PBS+10%胎牛血清洗3 次，每次以500 rpm 短時(shí)低速離心除去細(xì)胞碎片，以200 目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾去細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107 /ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用胎牛血清懸起細(xì)胞濃度為1×107/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

勻漿器法：

用眼科剪將組織剪成小塊；放入70 ml 組織研磨器內(nèi)，加入2 ml PBS+10%胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研磨至勻漿；用10 ml PBS+10%胎牛血清沖洗研器；收集細(xì)胞懸液，經(jīng)200 目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾；離心沉淀800 prm×2 min ，再用PBS 洗3 次，離心沉淀。以下處理同剪碎法。

細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：

細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）進(jìn)行。即可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。

計(jì)數(shù)與計(jì)算過(guò)程：

1）、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4）、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：細(xì)胞密度＝（4 個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104 個(gè)/ml ×稀釋倍數(shù)公式中乘以104 因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：

1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104 個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到2 個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說(shuō)明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個(gè)/10mm2 或>500 個(gè)/10 mm2時(shí)，說(shuō)明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。

2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。

5. 操作時(shí)，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑校駝t要重新計(jì)數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：

1. 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

3. 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

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