隨著去除核糖體測序技術(shù)深入發(fā)展，越來越多的環(huán)狀RNA（circRNA）不斷報道發(fā)現(xiàn)，基于生物信息學(xué)分析顯示circRNA發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能。然后如何采用實驗手段進(jìn)一步驗證circRNA的生物學(xué)功能顯得尤為重要，本文帶大家一起探討circRNA功能驗證策略。

1. circRNA定量驗證

circRNA定量驗證手段與常規(guī)PCR手段不同，常規(guī)手段是圍繞目的片段的上下游分別設(shè)計PCR引物，稱之為convergent primer，需擴(kuò)增的片段位于上下游引物之間（如圖1.1）。而對于circRNA，尤其外顯子環(huán)化circRNA，除backsplice junction位點處不同于linear RNA之外，body區(qū)與linearRNA是一致的。因此，驗證時需要特異性針對backsplice junction位點處設(shè)計primer，稱之為divergent primer（如圖1.1），而且設(shè)計的PCR product的長度越短越好，可以增強(qiáng)backsplice junction位點處擴(kuò)增效率。

圖1.1 convergent primer vs divergent primer

為增強(qiáng)circRNA的驗證效率，起始模版需滿足以下要求（3 free）：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。

驗證策略：對3free RNA以及genome DNA同時進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測PCR product大小（如圖1.2）。

圖1.2 circRNA引物擴(kuò)增結(jié)果

2. circRNA Northern blot驗證

Northern blot方法是一種比較古老但行之有效的序列驗證方法，需圍繞circRNA設(shè)計探針序列，而探針序列設(shè)計是驗證成功至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。對于circRNA探針設(shè)計，我們建議以下兩點：1. 對于外顯子環(huán)化circRNA，建議探針盡可能跨backsplice junction位點；2.對內(nèi)含子環(huán)化circRNA，可圍繞內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計探針。

驗證策略：對3 free RNA、total RNA以及genome DNA同時進(jìn)行雜交驗證。

3. circRNA過表達(dá)

circRNA過表達(dá)思想主要源于circRNA生物形成機(jī)制，已有多篇文章報道circRNA成環(huán)機(jī)制，目前比較*的成環(huán)機(jī)制為circRNA側(cè)翼序列的堿基互補(bǔ)配對，稱之為Alu結(jié)構(gòu)（如圖2）。

圖2 circRNA側(cè)翼結(jié)構(gòu)特征

基于circRNA側(cè)翼Alu序列特征，PCR擴(kuò)增含側(cè)翼Alu序列的目標(biāo)DNA序列，隨后依據(jù)對應(yīng)限制性內(nèi)切酶位點進(jìn)行酶切，進(jìn)而連接pEGFP-C1載體。連接載體進(jìn)而轉(zhuǎn)染對應(yīng)細(xì)胞樣本，定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。基于divergent primer驗證circRNA過表達(dá)倍數(shù)。

過表達(dá)策略：1. 擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域包含circRNA側(cè)翼Alu序列或內(nèi)部堿基互補(bǔ)序列，側(cè)翼上下游1kb處過表達(dá)效率更佳；2. 目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增基于基因組DNA為模版。

4. circRNA敲除

circRNA敲除思路主要針對circRNA backsplice junction處序列信息設(shè)計siRNA，對于內(nèi)含子環(huán)化circRNA，也可針對內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計相應(yīng)siRNA進(jìn)行干擾。Divergent primer驗證circRNA敲除倍數(shù)。

敲除策略：

1. 外顯子環(huán)化circRNA，針對backsplice junction位點前后序列設(shè)計siRNA，如圖3所示；

2. 內(nèi)含子環(huán)化circRNA，除針對backsplice junction位點前后序列設(shè)計siRNA序列以外，也可針對內(nèi)含子區(qū)域序列設(shè)計siRNA。

3. 每個siRNA設(shè)計對應(yīng)的對照，backsplice junction位點一端互補(bǔ)配對，另一端錯配，如圖3所示。

圖3 基于siRNA敲除策略

參考文獻(xiàn)

1. New Phytologist (2015) doi: 10.1111/nph.13585.
2. Nature Structural&Molecular Biology (2015) doi:10.1038/nsmb.2959.

3. RNA (2013) 19:141–157.

4. Cell Reports (2015) 10, 170–177.

來源:聯(lián)川生物技術(shù)公司