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上海滬峰是一家專業(yè)經(jīng)營生物、儀器、試劑耗材的公司，在廣大用戶的幫助和支持下，經(jīng)過不懈的努力，已成為國內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)品的主要供應(yīng)商之一，代理許多*水平的高科技產(chǎn)品，包括分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、診斷等多個研究及應(yīng)用領(lǐng)域。公司的服務(wù)和業(yè)務(wù)網(wǎng)絡(luò)遍及全國，在同行獲得*。
要一次進(jìn)行這么多種反應(yīng)，我們當(dāng)然不想在反應(yīng)中缺了哪個組分。一般多重PCR需要更多的dNTP、鎂離子和聚合酶。Nichols推薦使用0.3 mM dNTP（而非標(biāo)準(zhǔn)的0.2 mM）、2.5 mM Mg2+（而非1.2至2 mM）以及每50μL反應(yīng)體系5 units聚合酶（而非1.25 units）。zui后再試試鹽濃度，“在優(yōu)化的時候，增加鹽總會有幫助，尤其能增加特異性。”
PCR master mix含有緩沖液、鹽、dNTP、Mg和聚合酶，如果我們使用常規(guī)1.25× 或1.5×的PCR master mix就已經(jīng)差不多做到了上述原則的三至五。另外，您還可以選用轉(zhuǎn)為多重PCR優(yōu)化的產(chǎn)品，例如NEB的多重PCR 5× Master Mix、Bio-Rad的iQ™ Multiplex Powermix、或者安捷倫的Brilliant Multiplex QPCR Master Mix。
據(jù)安捷倫的Mason介紹，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是經(jīng)過專門設(shè)計的，能夠很好的解決同一管中不同反應(yīng)相互競爭的問題。如果一個目標(biāo)片段出現(xiàn)1000次，而另一個目標(biāo)片段只出現(xiàn)了10次，那么后一個片段就很容易淪為背景。“我們的多重PCR試劑盒能夠在同一個管中準(zhǔn)確定量低豐度和高風(fēng)度的目標(biāo)片段，克服偏向性，”Mason說。
據(jù)安捷倫的Mason介紹，Brilliant Multiplex QPCR Master Mix是經(jīng)過專門設(shè)計的，能夠很好的解決同一管中不同反應(yīng)相互競爭的問題。如果一個目標(biāo)片段出現(xiàn)1000次，而另一個目標(biāo)片段只出現(xiàn)了10次，那么后一個片段就很容易淪為背景。“我們的多重PCR試劑盒能夠在同一個管中準(zhǔn)確定量低豐度和高風(fēng)度的目標(biāo)片段，克服偏向性，”Mason說。
我能擴(kuò)多少目標(biāo)片段一般來說，zui多能在同一個管中同時檢測到五個目標(biāo)片段，這既是出于引物設(shè)計的考慮，也是由多重定量PCR的硬件條件決定的。實(shí)時熒光PCR儀通常zui多檢測4至5個顏色通道，其中一個可能還要留作參考通道。凝膠電泳雖然不受此限制，但多引物一同作用仍然存在困難，因此還是zui多達(dá)到五重PCR。 “設(shè)計更多是挑戰(zhàn)性的，”Cockrum說。
多重定量PCR的染料能進(jìn)行多重定量PCR的儀器包括：Life Tech公司的QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System、安捷倫公司的Mx30005P等等。目前zui流行的選擇是HEX、FAM和VIC，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的zui普遍的。Life Tech除了生產(chǎn)VIC外，近期又發(fā)布了兩個新染料ABY和JUN以及一個新passive reference dye——Mustang Purple。
多重定量PCR的染料能進(jìn)行多重定量PCR的儀器包括：Life Tech公司的QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System、安捷倫公司的Mx30005P等等。目前zui流行的選擇是HEX、FAM和VIC，而FAM/HEX和FAM/VIC是用的zui普遍的。Life Tech除了生產(chǎn)VIC外，近期又發(fā)布了兩個新染料ABY和JUN以及一個新passive reference dye——Mustang Purple。
Cockrum建議將染料強(qiáng)度與模板豐度結(jié)合起來，用zui亮的染料（通常是FAM）配zui少的模板，用zui黯淡的染料（例如Cy5或Quasar 705）配豐度zui高的模板（如看家基因）。
更多重的PCR當(dāng)然，引物設(shè)計是多重PCR的zui大障礙，不過一旦克服了這一障礙我們就能進(jìn)行更多重的PCR反應(yīng)。安捷倫的MassCode技術(shù)就能夠超越定量PCR儀帶來的硬件限制，安捷倫公司將這一技術(shù)推薦給那些想要同時篩選十個以上目標(biāo)片段的用戶，例如可以用來檢測病原體。
更多重的PCR當(dāng)然，引物設(shè)計是多重PCR的zui大障礙，不過一旦克服了這一障礙我們就能進(jìn)行更多重的PCR反應(yīng)。安捷倫的MassCode技術(shù)就能夠超越定量PCR儀帶來的硬件限制，安捷倫公司將這一技術(shù)推薦給那些想要同時篩選十個以上目標(biāo)片段的用戶，例如可以用來檢測病原體。
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