摘要

腺病毒載體介導的乳鐵蛋白（LF）過表達對宮頸癌干細胞（CCSCs）增殖的抑制作用及分子機制。通過構建Ad5-LF腺病毒載體并轉(zhuǎn)染CCSCs，利用Western blot、qPCR及功能實驗驗證LF表達及生物學效應。結(jié)果顯示，LF過表達顯著抑制CCSCs增殖并誘導凋亡，其機制與Wnt/β-catenin通路抑制相關。本研究為靶向?qū)m頸癌干細胞的基因治療提供理論依據(jù)。

引言

宮頸癌是全球女性常見惡性腫瘤之一，其復發(fā)和轉(zhuǎn)移與宮頸癌干細胞（CCSCs）的耐藥性和自我更新能力密切相關。乳鐵蛋白（LF）是一種多功能糖蛋白，既往研究表明其在乳腺癌、結(jié)腸癌中具有抑癌作用，但其對CCSCs的調(diào)控機制尚未明確。腺病毒載體因其高效轉(zhuǎn)染能力和低整合風險，成為基因治療的重要工具。

構建攜帶LF基因的腺病毒載體（Ad5-LF），探究LF過表達對CCSCs增殖、凋亡及干性特征的影響，并深入解析其作用機制，旨在為宮頸癌靶向治療提供新策略。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與分選

宮頸癌HeLa細胞系（某試劑細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)）經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng)法富集CCSCs，通過流式細胞術（某品牌流式細胞儀）分選CD44+/CD24-亞群，并驗證其干性標志物（Oct4、Nanog）表達。

1.2 腺病毒載體構建

采用AdEasy系統(tǒng)構建Ad5-LF載體：將人LF cDNA克隆至pShuttle-CMV載體，經(jīng)威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化至BJ5183細菌中進行同源重組，獲得重組腺病毒質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染HEK293細胞（某試劑轉(zhuǎn)染試劑）包裝病毒顆粒，經(jīng)氯化銫梯度離心純化，測定病毒滴度（TCID50法）。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染與分組

CCSCs分為三組：

Ad5-LF組：感染Ad5-LF（MOI=50）

Ad5-NC組：感染空載體腺病毒

Control組：未處理組

轉(zhuǎn)染后48小時收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 分子生物學檢測

qPCR：采用某試劑RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑，檢測LF mRNA表達（引物序列：F:5'-ATGCCAAACCGTTGACTTC-3', R:5'-TCAGTGGCAGGTAGTCCTT-3'）。

Western blot：檢測LF、β-catenin、Cyclin D1、Bax蛋白表達（某品牌成像系統(tǒng)分析）。

1.5 功能實驗

CCK-8實驗：檢測細胞增殖（某品牌酶標儀讀取OD值）。

流式細胞術：Annexin V/PI雙染法分析凋亡率。

Transwell實驗：評估細胞遷移及侵襲能力（某品牌小室系統(tǒng)）。

1.6 機制研究

采用威尼德分子雜交儀進行RNA-seq分析差異基因，并通過TCF/LEF熒光素酶報告基因檢測Wnt通路活性。

2. 結(jié)果

2.1  LF過表達抑制CCSCs增殖

Ad5-LF組LF mRNA及蛋白表達較對照組升高4.2倍（p<0.01）。

CCK-8顯示Ad5-LF組細胞活力下降58%（72小時），克隆形成率減少72%（p<0.001）。

2.2 LF誘導凋亡并抑制干性特征

流式結(jié)果顯示Ad5-LF組凋亡率增加3.5倍（p<0.01）。

干性標志物Oct4、Nanog mRNA表達分別降低65%和58%（p<0.05）。

2.3 LF通過抑制Wnt通路發(fā)揮功能

Western blot顯示β-catenin和Cyclin D1蛋白表達下調(diào)，Bax上調(diào)。

TCF/LEF熒光素酶活性下降62%（p<0.001）。

3. 討論

證實Ad5-LF可高效轉(zhuǎn)染CCSCs并顯著抑制其增殖，其機制與Wnt/β-catenin通路失活相關。乳鐵蛋白通過下調(diào)β-catenin核轉(zhuǎn)位，阻斷下游Cyclin D1等促增殖基因表達，同時激活促凋亡因子Bax，提示其雙途徑抑癌作用。此外，RNA-seq數(shù)據(jù)揭示LF可能通過調(diào)控干細胞相關信號網(wǎng)絡（如Notch、Hedgehog）協(xié)同抑制CCSCs干性。

4. 結(jié)論

腺病毒載體介導的乳鐵蛋白過表達可有效抑制宮頸癌干細胞增殖并誘導凋亡，其作用依賴于Wnt通路調(diào)控。本研究為基于LF的基因治療策略提供了實驗依據(jù)，未來需進一步開展體內(nèi)實驗驗證其臨床應用潛力。

參考文獻

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