簡(jiǎn)介

活性藥物成分（API）及其相關(guān)物質(zhì)（RS）等小分子（分子量小于1000da 或 g/mol）的合成是藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵步驟。這個(gè)過(guò)程包括產(chǎn)生治療效果的核心化合物。它需要有機(jī)化學(xué)、化學(xué)工程和分析技術(shù)的結(jié)合，以確保最終產(chǎn)品符合嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

API-RS 合成的一個(gè)關(guān)鍵是優(yōu)化反應(yīng)條件以獲得一致和可重復(fù)的結(jié)果。一旦反應(yīng)完成，第一次純化即可將原料藥從副產(chǎn)物、雜質(zhì)和未反應(yīng)物質(zhì)中分離出來(lái)。

純化技術(shù)，包括結(jié)晶、蒸餾和色譜，結(jié)晶分離固體原料藥是通過(guò)將粗產(chǎn)物溶解在合適的溶劑中，并在控制條件下誘導(dǎo)晶體形成。對(duì)于更復(fù)雜的混合物，使用色譜法，從密切相關(guān)的雜質(zhì)中精確分離目標(biāo)化合物。純化對(duì)于滿(mǎn)足有關(guān)效力、純度和穩(wěn)定性的要求以及確保最終藥品的療效和安全性至關(guān)重要。

在使用正相或反相色譜法純化溫度敏感物質(zhì)后，必須去除任何殘留溶劑。冷凍干燥優(yōu)于其他干燥技術(shù)，是因?yàn)樗梢杂行У厝コ軇瑫r(shí)保持最終純化樣品的完整性。冷凍干燥對(duì)于穩(wěn)定熱或熱敏產(chǎn)品或在傳統(tǒng)干燥方法（包括空氣干燥、真空干燥或使用干燥器）中可能降解的產(chǎn)品具有重要意義。得到的最終樣品可以長(zhǎng)期保存以作進(jìn)一步的分析或研究。

設(shè)備、試劑和材料

• 色譜系統(tǒng) PrepChrom™ C-700, BÜCHI Labortechnik AG

• C18色譜柱（10 μm）

• 冷凍干燥機(jī) Lyovapor™ L-250 Basic, BÜCHI Labortechnik AG

• 精準(zhǔn)真空控制系統(tǒng)

• 12位歧管頂蓋干燥室

• 普發(fā) Duo 6 雙級(jí)旋片真空泵

• 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Rotavapor R-300 帶杜瓦瓶

• 丙酮

• 干冰

• 液氮

• 圓底燒瓶（50、100、200、500、1000mL）

• 乙腈 99.9%，Honeywell

• 乙醇 90%，默克（1.00983.1011）

• 甲醇 90%，默克（1.06009.2500）

• 三氟乙酸 99.9%，Carl Roth（6957.20）

• 丙酮 99.5%，Honeywell（8.22251）

• 乙酸 95.9%，Carl Roth （T179）

純化與分離

制備型液相色譜（Prep LC）的目的是分離化合物，保證數(shù)量和純度足以進(jìn)一步分析。該技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域都是有所應(yīng)用的，其目的是使目標(biāo)化合物的最終純度達(dá)到≥95%。

3.1 分離方式：

通過(guò)反相色譜進(jìn)行分離，反相是液相色譜中常用的技術(shù)。在這種方法中，固定相的極性比洗脫溶劑小，洗脫溶劑通常由水和有機(jī)溶劑（如乙腈或甲醇）的混合物組成。

3.2 快速方法開(kāi)發(fā)：

對(duì)于反相分離，方法開(kāi)發(fā)通常從 C18柱（10 μm, 30 x 300 mm）開(kāi)始，使用酸性或堿性pH緩沖液，以?xún)?yōu)化目標(biāo)化合物的溶劑系統(tǒng)。流動(dòng)相由兩部分組成：水相（設(shè)為流動(dòng)相A）和有機(jī)溶劑（設(shè)為流動(dòng)相B）。流動(dòng)相由溶劑混合物組成，包括乙腈（60-80%）、甲醇（10-60%）、三氟乙酸（TFA）、乙酸和水。

3.3 餾分收集：

餾分收集可以手動(dòng)或自動(dòng)收集，自動(dòng)化通常是由紫外線(xiàn)探測(cè)器信號(hào)觸發(fā)。一種常見(jiàn)的自動(dòng)化方法是基于峰值的收集，當(dāng)檢測(cè)器信號(hào)達(dá)到預(yù)定義的閾值（如特定的高度或坡度標(biāo)準(zhǔn)）時(shí)收集分?jǐn)?shù)。

3.4 餾分分析與回收：

收集后，使用高效液相色譜法和回收率方法評(píng)估餾分的純度，以評(píng)估純化過(guò)程的效率和產(chǎn)量?；厥辗椒ǎ缱贤夤庾V（UV）、質(zhì)譜（MS）和核磁共振（NMR），側(cè)重于定量收集的餾分中目標(biāo)化合物的數(shù)量和純度驗(yàn)證。進(jìn)行回收率計(jì)算以確定收率。

化合物的回收率通常以系統(tǒng)化合物初始量的百分比來(lái)計(jì)算：

如果沒(méi)有達(dá)到期望的純度或產(chǎn)量，可能需要重新進(jìn)行純化。此外，優(yōu)化樣品溶解度或穩(wěn)定性可以需要提高回收率。

冷凍干燥

Lyovapor™ L-250 儀器的啟動(dòng)從程序預(yù)調(diào)節(jié)開(kāi)始，包括冰冷凝器的降溫和真空泵的預(yù)熱。此步驟大約需要 30 分鐘。

同時(shí)，準(zhǔn)備樣品預(yù)凍，樣品的冷凍過(guò)程因溶劑混合物的不同而不同。將以乙腈為主要溶劑的樣品冷凍在丙酮和干冰的混合物中，冷浴溫度在 -75℃ 左右。對(duì)于含有乙醇或甲醇的樣品，需使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除這類(lèi)溶劑；這一步是必需的，因?yàn)榧状嫉臉O低冷凍點(diǎn)和在真空低壓下的潛在蒸發(fā)可能使冷凍干燥過(guò)程復(fù)雜化。其他類(lèi)型的溶劑用液氮在 -196℃ 冷凍。

使用杜瓦瓶配件和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀冷凍圓底燒瓶中的所有樣品，如 圖1 和 圖2 所示。這種旋轉(zhuǎn)冷凍技術(shù)可將液體樣品冷凍成一個(gè)均勻的薄層，具有更大的蒸發(fā)表面積，顯著減少處理時(shí)間加速樣品干燥。干燥過(guò)程的真空壓力設(shè)在 0.50 mbar，樣品被單獨(dú)地裝載到歧管閥上。在真空度達(dá)到設(shè)定值后，或在 15 分鐘內(nèi)，將下一個(gè)樣品裝載到歧管上。

干燥過(guò)程完成時(shí)，燒瓶的外表面沒(méi)有冰，樣品看起來(lái)是干粉。然后將干燥的樣品小心地取出，根據(jù)樣品材料的穩(wěn)定性，在 0°C 或室溫下儲(chǔ)存。在某些情況下，使用氮?dú)鈦?lái)防止受潮。采取這些預(yù)防措施是為了確保樣品的完整性，以供后續(xù)分析。

結(jié)果

將下列樣品進(jìn)行冷凍干燥，以去除其中的溶劑和溶劑殘留物。獲得的 API-RS 可用于疾病治療，如下所述。

該過(guò)程的持續(xù)時(shí)間范圍從大約 4 到 20 小時(shí)，取決于樣品體積和溶劑組成。一般來(lái)說(shuō)，與有機(jī)混合物相比，水需要更長(zhǎng)的干燥時(shí)間。在這個(gè)過(guò)程中，沒(méi)有樣品顯示出塌陷或融化的跡象。本研究的目的是冷凍干燥使用 Lyovapor™ L-250 Basic 成功處理的各種樣品。