雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)是指以熒光素（luciferin）和腔腸素（coelenterazine）為底物，檢測螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）和海腎熒光素酶活性的一種雙報告系統(tǒng)。螢火蟲熒光素酶作為報告基因，催化luciferin 氧化成oxyluciferin，在luciferin 氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光；海腎熒光素酶作為內參基因，催化coelenterazine 氧化成coelenteramide，在coelenterazine 氧化的過程中，同樣也會發(fā)出生物熒光。通過熒光測定儀測定反應過程中釋放的生物熒光或使用酶標儀來檢測熒光素酶活性的變化。

圖1.熒光素酶生物發(fā)光化學反應示意圖

雙熒光素酶系統(tǒng)（Firefly & Renilla Luciferase）是基因調控研究的“黃金搭檔”，通過雙信號校正技術，可有效消除實驗誤差（如細胞數量、轉染效率等干擾），顯著提升數據穩(wěn)定性和靈敏度。

雙熒光素酶驗證轉錄因子與啟動子區(qū)調控作用

轉錄因子是一類參與基因轉錄調控的重要調節(jié)因子。不同轉錄因子的DNA 結合結構域識別不同基因啟動子區(qū)特定的堿基序列，行使抑制或激活該基因轉錄的功能。如圖3，將目的基因啟動子區(qū)域（通常取轉錄起始位點TSS 上游-2000bp）、或針對結合位點進行突變、或分段截斷序列，構建到報告基因載體luciferase 的上游，共轉染轉錄因子過表達質粒，通過熒光素酶活反映轉錄因子對啟動子活性的調控作用。

常用載體：pGL3-Basic 、pGL3-Promoter

1）轉錄因子NC + 啟動子對照質粒 + 海腎內參質粒；

2）轉錄因子NC + 啟動子野生型質粒 + 海腎內參質粒；

3）轉錄因子NC + 啟動子突變型質粒 + 海腎內參質粒；

4）轉錄因子質粒 + 啟動子對照質粒 + 海腎內參質粒；

5）轉錄因子質粒 + 啟動子野生型質粒 + 海腎內參質粒；

6）轉錄因子質粒 + 啟動子突變型質粒 + 海腎內參質粒。

1、啟動子報告基因載體構建：將目的基因構建至雙熒光素酶報告基因載體的上，目的片段位于熒光素酶報告基因的上游，如構建至pGL3-basic。
2、轉染細胞：將熒光素酶報告質粒與內參報告質粒和共轉染目的細胞，由于內參的啟動子活性較強，通常報告質粒與內參質粒的轉染比例為10:1。
3、收集細胞：將裂解液加入細胞孔中，搖床常溫條件下?lián)u晃適當時間后進行離心，將上清轉移到新的管子中。
4、雙熒光素酶報告基因活性檢測：96 孔酶標版中加入20 ul細胞裂解液上清，加入100 μL螢火蟲螢光素酶反應液，震板混勻，檢測螢火蟲螢光素酶的活力，檢測盡量在30 min內完成。加入100 μL海腎螢光素酶反應液，震板混勻，檢測海腎螢光素酶的活力，檢測盡量在30 min內完成。。
5、數據處理：首先將Firefly luciferase/Renila luciferase得出比值，即可得到不同處理組的相對luciferase活性。

（1）轉錄因子促進靶基因啟動子區(qū)轉錄活性

（2）轉錄因子抑制靶基因啟動子區(qū)轉錄活性

無論是基礎研究還是藥物開發(fā)項目，我們的雙熒光素酶報告基因檢測服務都將成為您探索基因調控機制的強力工具。