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實(shí)驗(yàn)材料：
1.cDNA樣本：通過上游反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA。
2.熒光定量試劑：Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No/Low/High Rox)。
3.其他試劑：RNase-free H2O、相關(guān)基因上下游引物(儲(chǔ)存濃度10 μM)。
4.設(shè)備與耗材：移液器、qPCR儀、冰盒、離心機(jī)、RNase-free八連排、RNase-free離心管。
實(shí)驗(yàn)步驟：
試劑&樣本前期準(zhǔn)備
試劑解凍和混勻
從冰箱中取出：
從-20℃冰箱中取出含酶試劑，立即放入冰盒中（冰上操作）；
避免將試劑直接放在室溫下解凍，以免溫度波動(dòng)影響酶的活性。
緩慢解凍：
讓試劑在冰上自然解凍，通常需要5-10分鐘；
如果需要快速解凍，可以將試劑握在手中輕輕搖晃，但不要過度加熱。
輕輕顛倒混勻：
解凍后，將試劑管輕輕上下顛倒幾次，使試劑充分混勻；
避免劇烈震蕩或渦旋混勻，以免破壞酶的活性。
低速離心：
將試劑管短暫離心（5-10秒，1000 rpm左右），使管壁和管蓋上的液體集中到管底；
離心后再次輕輕混勻，確保試劑均勻分布；
混勻后的試劑應(yīng)繼續(xù)放在冰上，避免長時(shí)間暴露在室溫下。
Tips：混勻時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，氣泡可能會(huì)影響酶的活性或?qū)嶒?yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
模板稀釋(若需要)
稀釋步驟
若需追蹤模板，按以下步驟稀釋：
取1 μL 10×Dilution Buffer + 9 μL無菌超純水 → 配制1×Dilution Buffer；
用1×Dilution Buffer稀釋cDNA至目標(biāo)濃度（建議稀釋至Ct值20-30的范圍內(nèi)）。
若無需追蹤模板，直接用無菌超純水稀釋cDNA或者直接使用cDNA原液。
熒光定量PCR反應(yīng)體系配制
常見的熒光定量儀器為96孔反應(yīng)，大體分為12列×8行。舉例說明：
備注說明：
相對(duì)定量分析基因表達(dá)情況時(shí)，為排除樣本和操作的影響，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，需要有內(nèi)參基因，例如GAPDH、β-actin等等。
技術(shù)重復(fù)通常建議設(shè)置3孔，為保證后續(xù)取平均值或剔除異常值。當(dāng)然根據(jù)自己的需求進(jìn)行調(diào)整，設(shè)置2孔重復(fù)或者4孔重復(fù)均可。
依據(jù)MIQE準(zhǔn)則，NTC(陰性對(duì)照)建議設(shè)置，一方面用于污染風(fēng)險(xiǎn)判斷，另一方面其也是一套實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (qPCR) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)報(bào)告實(shí)踐指南以及與發(fā)文共享實(shí)驗(yàn)信息的標(biāo)準(zhǔn)。
熒光定量PCR體系（大體系配制減少誤差）
以上述投入2μL cDNA模板檢測(cè)不同樣本基因1為例：
將上述溶液依次加好后，將管蓋蓋嚴(yán)，用手輕彈管壁，使各組分充分混勻，再放入小型離心機(jī)，短暫離心1-2s，再次輕彈管壁（防止有氣泡），瞬間離心（防止部分溶液沾到管壁上）并置于冰/冰板上。
備注：如使用顯蹤劑建議模板投入體積控制在2-5 μL，以保證顯蹤效果，如使用cDNA母液建議投入體積控制在2 μL(反應(yīng)體系的1/10)以內(nèi)防止影響擴(kuò)增效果。
按照上機(jī)儀器選取對(duì)應(yīng)耗材（八聯(lián)排或96孔板）。
在對(duì)應(yīng)耗材中按照布板依次分裝18μL/孔步驟1)配置的大體系Mix。
在每個(gè)孔中加入2 μL對(duì)應(yīng)模板。
移液槍加樣Tips(吸一排二)：
吸取液體：緩慢、平穩(wěn)地按下按鈕至第一檔(不是按到底)，然后將吸頭浸入液面下，然后緩慢、平穩(wěn)地松開檔位至原位來吸取液體。注意不要讓吸頭接觸到容器的邊緣或底部，以防止污染。
液體排出：將吸頭對(duì)準(zhǔn)接收容器，然后緩慢、平穩(wěn)地按下按鈕至第二檔(按到底)以排出液體。確保所有的液體都被排出。
完成加樣后，將管蓋蓋嚴(yán)，用手輕彈管壁，使各組分充分混勻，再放入小型離心機(jī)，短暫離心1-2s，再次輕彈管壁（防止有氣泡），瞬間離心（防止部分溶液沾到管壁上）確保無氣泡后置于潔凈的96孔PCR管架。
備注：注意觀察每一槍是否吸到了氣泡，若出現(xiàn)氣泡吸取則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出現(xiàn)較大偏差。
熒光定量PCR上機(jī)運(yùn)行
上機(jī)前，仔細(xì)檢查管子，確保正上方管蓋、管身沒有記號(hào)筆染料，管內(nèi)無氣泡、管壁無液體。
若采用常規(guī)程序，則進(jìn)行以下設(shè)置：
備注：
不同熒光定量qPCR試劑核心的酶和Buffer組成都存在差異，對(duì)應(yīng)說明書上的程序是該產(chǎn)品大多數(shù)情況下的最適反應(yīng)條件，建議按照說明書的程序進(jìn)行儀器設(shè)置，減少因用其他程序帶來的數(shù)據(jù)偏差；
熔解曲線程序可選用儀器默認(rèn)程序。
備注：以ABI Q5常規(guī)程序?yàn)槔?，在進(jìn)行程序設(shè)置時(shí)，確保在退火/延伸階段和熔解曲線的升溫階段打開數(shù)據(jù)信號(hào)收集開關(guān)。
若采用快速程序，需確認(rèn)儀器本身是否可以快速升降溫，運(yùn)行快速程序。以下以ABI Q5為例：
結(jié)果判定
觀察熔解曲線峰是否單一。
初步判斷復(fù)孔間Ct值差距是否＜0.5，或者進(jìn)一步計(jì)算復(fù)孔間CT值STD是否＜0.2。
內(nèi)參基因Ct值盡量在14-25之內(nèi)，不要過小也不要過大。
數(shù)據(jù)分析
下機(jī)得到的Excel數(shù)據(jù)處理如下：
圖示說明：
④：對(duì)照組校正后的數(shù)值；
③/④：每個(gè)小組校正后的數(shù)值比上對(duì)照組校正后的數(shù)值；
意圖表上的數(shù)據(jù)在excel中采用了保留2位小數(shù)的形式，實(shí)際計(jì)算時(shí)不可忽略小數(shù)點(diǎn)后的所有數(shù)字，減少按數(shù)字的動(dòng)作，活用Excel。
注意事項(xiàng)
1、引物設(shè)計(jì)好壞對(duì)于最終實(shí)驗(yàn)的成功和實(shí)驗(yàn)結(jié)果都會(huì)有一定的影響，可參考干貨軟文，解鎖更多引物設(shè)計(jì)寶藏。
2、長時(shí)間放置的引物，建議嘗試先用預(yù)實(shí)驗(yàn)(跟著其他實(shí)驗(yàn)或人帶上幾孔測(cè)測(cè)看)，避免直接進(jìn)行大規(guī)模正式實(shí)驗(yàn)，從而造成不必要的風(fēng)險(xiǎn)損失。
產(chǎn)品特別推薦：
方法 | 分類 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) |
RNA提取 | 同Trizol提取 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent | 10606ES |
免氯仿升級(jí)版 | TRIeasy™ Total RNA Extraction Reagent(Tcm Free) | 19202ES | |
動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取，避開有毒試劑，最快15 min完成 | MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒 | 19221ES | |
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5 min一步gDNA去除&反轉(zhuǎn)錄預(yù)混液(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® AdvanceFast One-step RT-gDNA Digestion SuperMix for qPCR | 11151ES | |
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高質(zhì)量一鏈cDNA合成預(yù)混液，含gDNA去除(下游應(yīng)用qPCR) | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES | |
qPCR染料法 | 高靈敏顯色示蹤熒光定量預(yù)混液(染料法) | Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | 11188ES |
Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox) | 11189ES | ||
Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox) | 11190ES | ||
高特異高熒光值定量預(yù)混液(染料法) | Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix | 11185ES | |
高靈敏通用型定量預(yù)混液(染料法) | Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | 11184ES |
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