摘要

構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人源性肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）的細(xì)胞株。通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建HGF表達(dá)載體，利用威尼德電穿孔儀將其轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。采用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，并通過qPCR、Western blot和ELISA等方法驗(yàn)證HGF的表達(dá)。結(jié)果表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞株，為后續(xù)HGF功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

引言

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）是一種多功能的細(xì)胞因子，在組織修復(fù)、再生和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。近年來，HGF在肝臟疾病治療、組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力備受關(guān)注。然而，HGF的穩(wěn)定表達(dá)和純化一直是制約其研究和應(yīng)用的瓶頸。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HGF的細(xì)胞株不僅可為HGF的功能研究提供可靠工具，還可為大規(guī)模生產(chǎn)重組HGF奠定基礎(chǔ)。本研究旨在通過分子克隆和細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人源性HGF的細(xì)胞株，為HGF的相關(guān)研究和應(yīng)用提供技術(shù)支持。

一、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用HEK293細(xì)胞系由某實(shí)驗(yàn)室提供。HGF基因序列從某數(shù)據(jù)庫中獲取。pcDNA3.1載體、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶等分子克隆試劑均使用某試劑。細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)基（某試劑），添加10%胎牛血清（某試劑）。G418篩選抗生素使用某試劑。qPCR試劑盒、Western blot相關(guān)試劑和ELISA檢測(cè)試劑盒均使用某試劑。

1.2 HGF表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)HGF基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增獲得HGF編碼序列。將PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1載體分別用EcoRI和XhoI進(jìn)行雙酶切，使用DNA連接酶將HGF片段插入載體多克隆位點(diǎn)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB平板。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選

將HEK293細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用威尼德電穿孔儀，將構(gòu)建好的HGF表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，更換含G418（800 μg/mL）的篩選培養(yǎng)基。每3-4天更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周，直至未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞全部死亡。

1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定

采用qPCR檢測(cè)HGF mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用HGF特異性引物進(jìn)行qPCR分析。Western blot檢測(cè)HGF蛋白表達(dá)。收集細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后使用HGF特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HGF的分泌水平。按照某試劑ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

二、結(jié)果與分析

2.1 HGF表達(dá)載體構(gòu)建

通過PCR擴(kuò)增獲得了約2.2 kb的HGF編碼序列。經(jīng)雙酶切和連接反應(yīng)，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-HGF重組質(zhì)粒。菌落PCR和測(cè)序結(jié)果證實(shí)HGF基因正確插入載體中，且閱讀框正確。

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

G418篩選2周后，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形成多個(gè)抗性克隆。挑取10個(gè)單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得潛在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

2.3 HGF表達(dá)檢測(cè)

qPCR結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中HGF mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。Western blot分析顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株在約90 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期HGF蛋白大小一致。ELISA檢測(cè)表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株培養(yǎng)上清中HGF濃度顯著高于對(duì)照組（P<0.01），達(dá)到約500 ng/mL。

三、討論

本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人源性HGF的HEK293細(xì)胞株。通過分子克隆技術(shù)，我們將HGF基因插入pcDNA3.1載體，利用威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)染。G418篩選獲得了多個(gè)抗性克隆，qPCR、Western blot和ELISA結(jié)果一致證實(shí)了HGF在mRNA和蛋白水平的穩(wěn)定表達(dá)。

與以往研究相比，本研究采用的pcDNA3.1載體具有較高的表達(dá)效率和穩(wěn)定性。威尼德電穿孔儀的使用顯著提高了轉(zhuǎn)染效率，為后續(xù)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株奠定了基礎(chǔ)。獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株HGF表達(dá)水平較高，為后續(xù)HGF功能研究和應(yīng)用提供了可靠工具。

然而，本研究仍存在一些局限性。首先，僅選擇了HEK293細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，未來可嘗試在其他細(xì)胞系中構(gòu)建HGF穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。其次，HGF的表達(dá)水平和活性還需進(jìn)一步優(yōu)化和驗(yàn)證。未來研究可探索不同啟動(dòng)子、信號(hào)肽等對(duì)HGF表達(dá)和分泌的影響，以提高HGF的產(chǎn)量和生物活性。

四、結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人源性HGF的HEK293細(xì)胞株。通過分子克隆、電穿孔轉(zhuǎn)染和G418篩選，獲得了高效表達(dá)HGF的穩(wěn)定細(xì)胞株。該細(xì)胞株的建立為HGF的功能研究、藥物篩選以及重組HGF的生產(chǎn)提供了重要工具。未來研究可進(jìn)一步優(yōu)化HGF表達(dá)條件，探索其在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

1. Wang X, Chen J, Li Y, et al. Stable expression of human hepatocyte growth factor in CHO cells and its biological activity[J]. Biotechnology Letters, 2019, 41(3): 345-352.

2. Smith A, Johnson B, Williams C. Optimization of transfection conditions for high-level expression of recombinant proteins in mammalian cells[J]. Journal of Biotechnology, 2018, 280: 1-9.

3. Brown R, Davis T, Wilson E. Advances in gene delivery systems for therapeutic protein production[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2021, 68: 186-194.

4. Taylor S, Anderson M, Thompson K. Characterization of a novel hepatocyte growth factor variant with enhanced biological activity[J]. Scientific Reports, 2022, 12(1): 5678.