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細(xì)胞學(xué)堂 | 超全解析！神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化必看
神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）因具備獨(dú)-特的增殖能力與多向分化潛能，在神經(jīng)科學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。然而，在培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的過(guò)程中，科研人員常常會(huì)遇到培養(yǎng)要求高、分化控制難等挑戰(zhàn)。
那么，如何選擇合適的培養(yǎng)方式？不同培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞狀態(tài)有何影響？本文將深入介紹和解析神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法、誘導(dǎo)分化策略，并為您解答常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)難題，助力您的研究更進(jìn)一步！
神經(jīng)干細(xì)胞的基本介紹
神經(jīng)干細(xì)胞可以從不同的組織中分離獲得，常見(jiàn)的來(lái)源有胚胎、大腦皮層、海馬體和脊髓等。為了在體外成功培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，合適的培養(yǎng)體系至關(guān)重要，培養(yǎng)基的成分、添加劑的使用、培養(yǎng)條件等因素都對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、存活以及分化狀態(tài)有著深遠(yuǎn)的影響。
生長(zhǎng)培養(yǎng)基
常用配方：DMEM/F12 + B-27（不含維生素A）+ bFGF + EGF + 雙抗
為更好地滿足神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)需求，普諾賽®提供經(jīng)過(guò)配方優(yōu)化的神經(jīng)干細(xì)胞完-全培養(yǎng)基，助力您的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)工作更加高效、穩(wěn)定。
培養(yǎng)條件
氣相：空氣，95%；CO2，5%
溫度：37℃
神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要分為懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩大類，這兩種方法各具特色，適用于不同的研究需求。
懸浮培養(yǎng)
通過(guò)使用未經(jīng)TC（Tissue Culture）處理、未包被或低吸附的培養(yǎng)器皿和無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，自然形成神經(jīng)干細(xì)胞球。
貼壁培養(yǎng)
通過(guò)將神經(jīng)干細(xì)胞球消化分散成單個(gè)細(xì)胞后，接種在經(jīng)TC處理和包被的培養(yǎng)器皿內(nèi)，用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，形成貼壁生長(zhǎng)的單層細(xì)胞。
懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn)
懸浮培養(yǎng)
優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
可以形成穩(wěn)定的神經(jīng)球，保持未分化狀態(tài)，有利于長(zhǎng)期培養(yǎng)和大規(guī)模擴(kuò)增 | 易形成大細(xì)胞球，中心細(xì)胞易缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)死亡 |
懸浮培養(yǎng)早期增殖速率優(yōu)于貼壁培養(yǎng) | 懸浮培養(yǎng)自噬體形成增多，可能因?yàn)樯窠?jīng)球內(nèi)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏而激活自噬 |
培養(yǎng)條件和方法簡(jiǎn)單，分離培養(yǎng)成功率高，離心或半量換液操作簡(jiǎn)單 | 需要頻繁離心和重懸細(xì)胞，增加細(xì)胞損失 |
干性維持能力更強(qiáng)，相比貼壁培養(yǎng)不易分化 | 不利于誘導(dǎo)分化和分化形態(tài)觀察 |
貼壁培養(yǎng)
優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
能形成形態(tài)規(guī)則的單層細(xì)胞，傳代損耗低，容易觀察到細(xì)胞形態(tài)和分化階段，更有助于神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和存儲(chǔ) | 長(zhǎng)期培養(yǎng)易自發(fā)分化 |
貼壁培養(yǎng)的單層NSCs，與培養(yǎng)基接觸面更大，誘導(dǎo)分化成功率更高 | |
貼壁培養(yǎng)的NSCs經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后仍可保持較強(qiáng)的增殖能力，同時(shí)具有多分化潛能的特性 | NSCs貼壁不牢，易脫落，需使用TC處理和包被的培養(yǎng)器皿；細(xì)胞傳代操作復(fù)雜，傳代后易再次懸浮成球 |
貼壁培養(yǎng)的NSCs自噬水平較低，有利于維持細(xì)胞的穩(wěn)定性和增殖能力 |
神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
1）誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞
將神經(jīng)干細(xì)胞球體消化分散后離心，使用星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（DMEM高糖＋B-27，含維生素A＋N-2＋GlutaMAX＋FBS＋bFGF[1]）重懸細(xì)胞，鋪入多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。隨著誘導(dǎo)分化的進(jìn)行，神經(jīng)干細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾切文z質(zhì)細(xì)胞，其形態(tài)變化如圖1所示。
圖1. 神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化
2）誘導(dǎo)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞
與星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)方法類似，使用少突膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（DMEM/F12＋B-27，含維生素A＋EGF＋bFGF＋T3＋胰島素[2]）誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，其形態(tài)變化如圖2所示。
圖2. 神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化
3）誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞
將神經(jīng)干細(xì)胞球體消化分散后離心，使用神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Neurobasal神經(jīng)元培養(yǎng)基+1% N-2+2% B-27含維生素A+NEAA+β巰基乙醇+L-谷氨酰胺）重懸細(xì)胞，鋪入多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，在神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入10 ng/mL GDNF和10 ng/mL BDNF，以進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)元的分化[3]。
神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題解答
1）
如何準(zhǔn)確判斷神經(jīng)干細(xì)胞的傳代時(shí)機(jī)？
神經(jīng)干細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)需根據(jù)神經(jīng)干細(xì)胞球的大小和形態(tài)判斷。應(yīng)讓神經(jīng)干細(xì)胞球中間保持明亮，避免細(xì)胞球生長(zhǎng)過(guò)大。如圖3所示，右下角神經(jīng)干細(xì)胞球體過(guò)大，球中部發(fā)暗，應(yīng)該在這種狀態(tài)出現(xiàn)之前進(jìn)行傳代。一般而言，神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行1:2傳代后，大約2-3天可再次傳代。
圖3. 神經(jīng)干細(xì)胞球生長(zhǎng)形態(tài)
2）
神經(jīng)干細(xì)胞較難消化成單個(gè)細(xì)胞，是否必須完-全消化？
在懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞時(shí)，無(wú)需將神經(jīng)干細(xì)胞球徹-底消化至單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。而貼壁培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞時(shí)，需將其消化分散成單個(gè)細(xì)胞，這樣更利于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)（如圖4）。在此過(guò)程中，推薦使用Accutase酶，相較于常用的胰酶，Accutase酶消化作用更為溫和，能夠顯著降低對(duì)細(xì)胞的損傷風(fēng)險(xiǎn)。
圖4. 使用Accutase酶消化成單細(xì)胞接種圖
3）
懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，如何進(jìn)行換液？
建議采用半量換液法進(jìn)行操作，具體操作步驟如下：將培養(yǎng)瓶豎直靜置，待大部分細(xì)胞自然沉降后，吸棄原培養(yǎng)體積一半的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，補(bǔ)加等體積新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。為減少細(xì)胞損失，可將培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移至離心管中，使用離心機(jī)500 rpm離心5 min后，棄去上清，用等體積新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
無(wú)論是懸浮培養(yǎng)還是貼壁培養(yǎng)，都各有優(yōu)缺點(diǎn)，科研人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的方法。此外，掌握正確的誘導(dǎo)分化策略和優(yōu)化培養(yǎng)條件，能夠有效提升神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)成功率。
希望本篇指南能為您的實(shí)驗(yàn)提供實(shí)用參考，如有更多疑問(wèn)，歡迎留言交流！更多細(xì)胞培養(yǎng)干貨，請(qǐng)持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專欄~
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質(zhì)控嚴(yán)格
無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體、噬菌體等污染，低內(nèi)毒素
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參考文獻(xiàn)
[1]
Sardar D, Lozzi B, Woo J, et al. Mapping Astrocyte Transcriptional Signatures in Response to Neuroactive Compounds[J]. International Journal of Molecular Sciences. 2021;22(8):3975.
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楊慧敏. 新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 重慶醫(yī)科大學(xué), 2006.
[3]
李登賀. 神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為中間神經(jīng)元的研究[D]. 昆明理工大學(xué), 2016.
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