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可電離脂質用于脂質納米顆粒介導的DNA遞送的比較研究

來源：邁安納（上海）儀器科技有限公司 2025年02月13日 16:02

“基因治療作為一種新興的治療方法，在遺傳性疾病、癌癥等領域展現出巨大潛力。LNPs作為非病毒基因載體，具有安全性高、制備簡便等優(yōu)點，被廣泛用于核酸遞送。LNPs的設計關鍵在于可電離脂質的選擇，其理化性質直接影響LNP的穩(wěn)定性和轉染效率。本研究旨在比較不同臨床用可電離脂質在LNP介導的DNA遞送中的性能，為優(yōu)化LNP基因載體提供實驗依據。”

圖一、DNA/LNP的設計和實驗驗證模型

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實驗材料

可電離脂質：DLin-MC3-DMA（MC3）、SM-102、ALC-0315。
輔助脂質：膽固醇、DOPC（二油酰磷脂酰膽堿）、DMPE-PEG2k（1,2-二甲基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000）。
DNA質粒：編碼熒光標記物或熒光素酶的DNA表達質粒（3-4kbp）。
細胞系：快速增殖的人肝癌HuH-7細胞和緩慢復制的mPH細胞。
實驗動物：野生型小鼠。

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結果

2.1 LNP理化性質表征：

本研究中，針對RNA遞送設計的LNP脂質組成被評估其用于結合DNA表達質粒的潛力。所生成的DNA-LNP的脂質組成包括：1) 可電離脂質，2) 膽固醇，3) 輔助脂質，和4) PEG偶聯脂質，摩爾比為50:39:10:1（圖1A）。比較了三種臨床上使用的可電離脂質，即DLin-MC3-DMA（MC3）、SM-102和ALC-0315。

通過微流控混合技術封裝納米質粒DNA后，對DNA-LNP進行了表征。所有DNA-LNP制劑均在N/P比為6（即可電離脂質與DNA的電荷比）的條件下生成。表征結果顯示，所有制劑均呈現出適宜的粒徑和ζ電位，確保了它們的穩(wěn)定性和細胞內攝取潛力。

圖二、DNA/LNP的表征

2.2 細胞轉染效率與基因表達：

為了評估LNP封裝的DNA的細胞攝取，使用Cy3標記了編碼EGFP的納米質粒DNA，并將其與HuH-7和mPH細胞孵育。DNA-LNP以10至50ng DNA/cm2的最終濃度添加，并孵育至72小時。通過流式細胞術和共聚焦顯微鏡分析細胞攝取和轉基因表達。

在HuH-7細胞中，MC3 LNPs顯示出最高的EGFP表達水平，約60%的細胞表達了EGFP，而ALC-0315 LNPs的表達水平略低（40%）。在mPH細胞中，由于強自發(fā)熒光，選擇了tdTomato作為報告基因進行成像。SM-102 LNPs在此細胞系中表現出優(yōu)勢，有7%的細胞表達了tdTomato，而ALC-0315 LNPs的表達水平顯著降低。

通過實時聚合酶鏈反應（qPCR）量化了DNA拷貝數的遞送。DNA-LNP孵育24小時后，使用QIAprep Spin Mini-prep Kit提取遞送的DNA，并制備DNA校準曲線以計算拷貝數。結果顯示，在HuH-7細胞中，MC3 LNPs遞送的DNA拷貝數最高，而在mPH細胞中，SM-102 LNPs顯示出最高的遞送效率。

圖三、DNA/LNP的體外攝取評價

圖四、DNA/LNP的體外轉染評價

2.3 生物分布分析：

通過尾靜脈注射向野生型小鼠體內遞送了封裝有20µg DNA的DNA-LNPs，并在24小時后處死小鼠以評估生物分布和轉基因表達。器官被收集、勻漿，并通過qPCR確定遞送的DNA拷貝數。結果顯示，肝臟和肺臟中積累了最高比例的熒光素酶DNA，分別為11.3±2.8%和7.5±1.9%的注射劑量（ID），而脾臟中的積累水平較低（2.6±0.7% ID）。這一趨勢在所有DNA-LNP制劑中均一致觀察到。

體內轉基因表達通過生物發(fā)光成像進行評估。在注射DNA-LNPs 24小時后，向小鼠腹腔注射d-熒光素，并使用生物成像系統(tǒng)監(jiān)測生物發(fā)光。結果顯示，MC3和SM-102 LNPs在肝臟中誘導了顯著的熒光素酶表達，而ALC-0315 LNPs的表達水平較低。這些結果與體外實驗結果一致，進一步證實了MC3和SM-102 LNPs在DNA遞送和轉基因表達方面的優(yōu)勢。

圖五、DNA/LNP在小鼠中的體內分布和表達

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討論

本研究表明，臨床用LNP制劑在設計用于DNA基因遞送時，需進行先期評估?？呻婋x脂質的選擇對LNP的理化性質、細胞轉染效率和基因表達水平具有重要影響。含有ALC-0315的LNP在體內實驗中表現出更高的轉基因表達水平，這可能與其有利的理化性質、良好的細胞攝取和基因遞送能力有關。然而，SM-102在某些細胞系中表現出更高的DNA遞送量和熒光強度，提示在不同細胞環(huán)境中可能需要選擇不同的可電離脂質以優(yōu)化基因遞送效果。

此外，LNP的粒徑、電荷等理化性質對細胞攝取和基因遞送具有重要影響。本研究中，含有ALC-0315的LNP粒徑小于100nm，有利于細胞攝取和基因遞送。未來研究可進一步探索LNP理化性質與基因遞送效率之間的關系，以優(yōu)化LNP設計。

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結論

本研究通過比較不同臨床用可電離脂質在LNP介導的DNA遞送中的性能，發(fā)現含有ALC-0315的LNP在體內實驗中表現出更高的轉基因表達水平。這一發(fā)現為LNP在DNA基因治療中的應用提供了有價值的見解，為未來優(yōu)化LNP基因載體提供了實驗依據。未來研究可進一步探索LNP理化性質、細胞攝取、基因遞送效率之間的復雜關系，以推動LNP在基因治療領域的廣泛應用。

參考文獻：Lotter, Claudia, et al. "Comparison of ionizable lipids for lipid nanoparticle mediated DNA delivery." European Journal of Pharmaceutical Sciences 203 (2024): 106898.

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