如何選擇HPLC制備柱

沃特世制備柱應(yīng)用選擇快速推薦表

從分析柱到制備柱直接放大，常用計算公式：

放大倍數(shù)-用于估算上樣量：

流速放大估算：

  流速可用于計算與分析柱應(yīng)用時完全相當(dāng)?shù)木€性流速條件下對應(yīng)于更大色譜柱的體積流速。但是，合理的流速將取決于柱規(guī)格。當(dāng)柱長增加、粒徑減小時，柱背壓會相應(yīng)增加，會受到液相系統(tǒng)耐壓性的限制。

梯度持續(xù)時間估算：

制備柱上樣量預(yù)估

對于OBD制備柱的大概上樣量(毫克)，梯度洗脫模式時：

¹合理流速取決于柱內(nèi)徑。隨柱長增加及填料粒徑減少，柱背壓增大，使用時會受到液相設(shè)備的耐壓性的限制。在制備柱上的梯度持續(xù)時間，應(yīng)按照與分析柱應(yīng)用時相等的梯度洗脫體積與柱體積之比的倍數(shù)因子計算(計算公式見“梯度持續(xù)時間估算”公式)。

²此處進樣體積數(shù)值基于50 mm柱長并使用較強溶劑溶解樣品時。如增加柱長，進樣體積亦可增加，但并不成正比。使用較弱強度的溶劑溶解樣品，能顯著提高進樣體積量。

制備柱的樣品載量受制于許多因素。左邊所列數(shù)據(jù)僅為“平均狀況下”的預(yù)估值。通常規(guī)律有：

■ 強保留的目標(biāo)物載量較大

■ 樣品簡單時載量較大

■ 需要高分辨時載量降低

■ 樣品載量受上樣條件影響很大：

- 受限于樣品體積

- 受限于樣品溶劑的強度

■ 對于肽樣品，其載量主要取決于目標(biāo)肽序列以及肽樣品的溶解性，建議按所列值的5-20%預(yù)估*。

裝填技術(shù)與柱硬件對性能的影響

  實驗室規(guī)模的HPLC分離純化對色譜工作者提出了諸多挑戰(zhàn)，其中一個最大的挑戰(zhàn)是制備色譜柱本身。由于柱與柱之間在性能和使用壽命上的不一致性，常常導(dǎo)致樣品損失、重復(fù)純化操作以及從小體積柱到大體積柱的放大能力差。沃特世科學(xué)家意識到這個問題的存在，歷經(jīng)三年，研究了裝填工藝過程中的所有因素以及柱設(shè)計本身。在此基礎(chǔ)上，沃特世公司于2003年推出了專利*技術(shù)OBDTM(Optimum Bed Density，最佳柱床密度)應(yīng)用于沃特世制備

柱產(chǎn)品。(*UK專利號 # GB2408469)。

  問題的根本原因就是在于，制備柱的柱床裝填必須足夠致密，才能在使用過程中能夠承受流動相壓力而仍保持穩(wěn)定的柱床狀態(tài)。傳統(tǒng)的勻漿裝填方法，用于分析柱規(guī)格時能夠產(chǎn)生必需的柱床密度；但是當(dāng)用于制備柱并使用較小粒徑填充制備柱時，隨著柱內(nèi)徑與長度的增加，就越來越難以達到柱長期使用仍能保持穩(wěn)定耐受時所必需的柱床密度。柱床密度的優(yōu)化，取決于色譜填料的特定性質(zhì)與所采用的柱設(shè)計。

沃特世OBD色譜柱設(shè)計

  沃特世已將高壓勻漿填充與經(jīng)過仔細(xì)計算的軸向壓縮因素相結(jié)合，應(yīng)對于柱頭裝填密度較小的部分。

  按照制備柱OBD設(shè)計理念，并按每種填料類型和每種柱規(guī)格的立體幾何學(xué)加以精心微調(diào)的實際操作工藝，就可以獲得可預(yù)測的、對整個柱床長度都均勻一致的裝填密度。在裝填結(jié)束后的封柱過程中，沃特世柱裝填操作依從仔細(xì)嚴(yán)格的操作流程，從而確保不會以任何不均勻的方式過度壓縮或擾動柱端部分。

  OBD制備柱硬件設(shè)計包括一對精心設(shè)計的分流板和化學(xué)惰性密封圈，以防止在高壓操作下出現(xiàn)漏液情況。

OBD制備柱裝配件圖解