檢測(cè)原理

2D Luminescent Cell Viability Assay借助ATP依賴的熒光素酶催化的熒光素發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光信號(hào)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP含量，從而檢測(cè)細(xì)胞活力或定量檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)目，檢測(cè)線性范圍寬、靈敏度高、穩(wěn)定性好。96孔板中，在100個(gè)至100,000個(gè)細(xì)胞范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，但不同細(xì)胞的檢測(cè)數(shù)量上限會(huì)有不同。此外，操作簡(jiǎn)單，試劑盒中提供的檢測(cè)試劑為即用型，讀數(shù)穩(wěn)定，檢測(cè)速度快，完成檢測(cè)僅需約10min，無(wú)需洗滌細(xì)胞，也無(wú)需更換或去除培養(yǎng)液。相比于其他常見(jiàn)的細(xì)胞活力測(cè)定方法，如Calcein-AT、CCK-8等，2D Luminescent Cell Viability Assay更加簡(jiǎn)單快捷。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

2D Luminescent Cell Viability Assay(abs50065)檢測(cè)靈敏度高、線性范圍寬，可兼容少量樣品檢測(cè)以及大量樣品的高通量篩選。

1、方便快速：試劑盒中提供的檢測(cè)試劑為即用型，讀數(shù)穩(wěn)定，檢測(cè)速度快，完成檢測(cè)僅需約 10 分鐘；

2、靈敏度高：能夠檢測(cè)zui低10nmol的ATP；

3、線性范圍寬：96孔板中，在100個(gè)至100,000個(gè)細(xì)胞范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，但不同細(xì)胞的檢測(cè)數(shù)量上限會(huì)有不同；

4、高通量：可兼容少量樣品檢測(cè)以及大量樣品的高通量篩選。

使用方法

一、試劑準(zhǔn)備

試劑融化：實(shí)驗(yàn)前一天將試劑取出，置于4℃過(guò)夜融化。也可在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將試劑取出，置于室溫融化，或放置于22℃水浴融化，但需要注意水溫不可超過(guò)25℃。

平衡至室溫：若試劑在非室溫條件下融化，使用前可將其置于22℃水浴，確保試劑平衡至室溫后再用于檢測(cè)。

注：一般針對(duì)5mL包裝需要約10min；50mL包裝需要約20min。

混勻：使用前輕柔顛倒5次使溶液混合均勻。

添加Triton X-100(abs9149)：吸取當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需體積的試劑，加入適量體積Triton X-100，使其終濃度為0.2%。該液體為檢測(cè)工作液（例如：8mLATP檢測(cè)試劑加0.2mL Triton X-100）。

二、檢測(cè)步驟

1、細(xì)胞培養(yǎng)

使用適合進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的96孔板(abs7149)，每孔接種100μL細(xì)胞（根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間確定初始接種的細(xì)胞密度，檢測(cè)時(shí)每孔細(xì)胞數(shù)量不宜超過(guò)10萬(wàn)個(gè)），同時(shí)設(shè)置不含細(xì)胞的培養(yǎng)液的孔作為陰性對(duì)照。也可以設(shè)置細(xì)胞的濃度梯度，以得到最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。37℃，5% CO₂培養(yǎng)細(xì)胞，根據(jù)需要在合適的時(shí)間加藥處理細(xì)胞。

2、（可選）ATP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

把制備的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液用PBS稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?/span>梯度，96孔板每孔加入100μL的標(biāo)準(zhǔn)品。

3、細(xì)胞活力檢測(cè)

（1）融解凍存的發(fā)光法檢測(cè)試劑，并平衡至室溫（或22℃恒溫水浴平衡），并取出當(dāng)次實(shí)驗(yàn)用體積的檢測(cè)試劑，添加適量Triton X-100（使其終濃度為0.2%）；

（2）取出細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫平衡10min（或22℃恒溫平衡，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，盡量控制在30min以內(nèi)）；

（3）96孔板每孔加入100μL檢測(cè)試劑（由于孔的邊緣效應(yīng)，可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)光信號(hào)不穩(wěn)定，不建議在邊緣鋪板）；

（4）室溫振蕩2min，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解；

（5）室溫放置10min，使發(fā)光信號(hào)趨于穩(wěn)定；

（6）使用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每孔的檢測(cè)時(shí)間一般為0.25-1s，具體需根據(jù)儀器的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；

（7）根據(jù)化學(xué)發(fā)光讀數(shù)計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活力，或根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ATP含量從而得出細(xì)胞的相對(duì)活力。

注：檢測(cè)效果因細(xì)胞的種類不同而異，對(duì)于一些ATP含量特別高的細(xì)胞，在細(xì)胞數(shù)量達(dá)到 100,000以上可能會(huì)出現(xiàn)化學(xué)發(fā)光讀數(shù)繼續(xù)升高，但喪失線性關(guān)系。

三、注意事項(xiàng)

1、溫度：試劑中含有熒光素酶，反復(fù)凍融會(huì)影響其活性。建議分裝后置于-20℃避光保存。試劑及細(xì)胞樣品使用前均需平衡至室溫，以避免酶催化效果的影響；

2、化學(xué)因素：熒光素酶的反應(yīng)速率和發(fā)光強(qiáng)度受化學(xué)環(huán)境影響。不同類型的培養(yǎng)基和血清中發(fā)光強(qiáng)度和衰減速率存在差異。另外，藥物含量較高時(shí)可能會(huì)干擾熒光素酶反應(yīng)，從而影響發(fā)光信號(hào)。建議設(shè)置含有藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)照孔以排除溶劑的干擾。如培養(yǎng)基對(duì)發(fā)光強(qiáng)度影響較大，可在檢測(cè)前去除，并用PBS潤(rùn)洗一次，此時(shí)，Triton X-100添加量減半，至終濃度0.1%即可；

3、光敏感：本試劑對(duì)光敏感，如果儲(chǔ)存時(shí)暴露在光照下，會(huì)加快發(fā)光強(qiáng)度的衰減。如果試劑從原來(lái)的容器轉(zhuǎn)移，請(qǐng)確保避光保存；

4、ATP 污染：建議操作時(shí)佩戴口罩和乳膠手套，避免接觸可能受到污染的表面和設(shè)備。操作時(shí)避免多次將槍頭jian端插入試劑瓶中。

今天講解就到這了，大家如有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，歡迎一起交流哦！

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