逆轉錄酶，1970年由Temin和Baltimore獨立發(fā)現(xiàn)，它能將RNA轉錄成cDNA，二人因此獲1975年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。逆轉錄酶包含多個功能域，分別為聚合酶域和RNase H域，其中聚合酶域進一步細分為“手指”、“手掌”和“拇指”三個亞域，分別參與模板結合、催化反應和結構支持[1]。在分子生物學中，尤其分子診斷領域，逆轉錄酶bu  ke  huo  que。它可將病毒RNA基因組轉為cDNA，再通過RT-qPCR、RT-LAMP、RNA測序等技術進行檢測，這一特性使得對諸如艾滋病、甲型流感以及乙型流感這類RNA病毒進行準確診斷成為可能。

圖1. 逆轉錄酶蛋白結構及其活性[2]

目前M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆轉錄酶是分子診斷試劑中常用的逆轉錄酶，然而，M-MLV逆轉錄酶在高溫條件下表現(xiàn)出相對較低的穩(wěn)定性，易發(fā)生失活現(xiàn)象。這一特性不僅對由其配制的預混液在長期儲存過程中的性能保持構成挑戰(zhàn)，同時也限制了其在需要較高溫度下進行逆轉錄反應的應用，因此提升逆轉錄酶的穩(wěn)定性是一個重要研究方向。

翌圣團隊憑借其子公司鎂孚泰生物ZymeEditor™創(chuàng)新型酶進化平臺，通過一系列干濕實驗的交互篩選，成功獲得了穩(wěn)定性提高的M-MLV突變體。在研發(fā)階段，團隊一方面采用了理性/半理性設計的策略，對MMLV進行了多維度、多層次的結構-功能分析?；谛蛄幸恢滦苑治觥-factor分析、吉布斯自由能變化分析以及二硫鍵設計等手段，確定結構中的熱點氨基酸，并設計能夠穩(wěn)定結構的定點突變，輸出穩(wěn)定性提升的M-MLV優(yōu)勢突變體。

圖2. 理性與半理性設計改造M-MLV穩(wěn)定性：(A) 理性與半理性設計及篩選過程；(B) 突變位點設計；(C)加速穩(wěn)定性表征數(shù)據(jù)

接著，團隊利用MTPS高通量篩選技術，對穩(wěn)定性、RNA/DNA催化的偏好性以及活力都進行了多維度篩選，最終獲得了具有性能提升的優(yōu)勢突變體。通過對這些突變體進行精細純化，并對其性能進行全面的酶學表征，最終成功獲得了多個cDNA產量顯著提升（接近3倍）的突變體。而且M-MLV突變體與對照WT的預混液保存6個月和12個月后的建庫產量對比數(shù)據(jù)表明，M-MLV突變體的建庫產量優(yōu)于對照WT，說明M-MLV突變體穩(wěn)定性更優(yōu)。

圖3. (A) 改造RNA和DNA依賴的DNA聚合酶活性提高cDNA產量; (B) M-MLV突變體與對照WT的cDNA產量對比; (C) M-MLV突變體與對照WT的預混液保存6個月和12個月后的建庫產量對比

團隊的這項研究獲得了多個穩(wěn)定性和cDNA產量提升的M-MLV突變體，為分子診斷試劑的開發(fā)提供了新的解決方案。通過對這些進化突變體進行全面的性能評估，包括加速穩(wěn)定性測試、預混試劑的穩(wěn)定性、靈敏度分析以及凍干技術的應用，我們精心挑選出綜合性能的突變體進行產業(yè)化生產。

今天我們隆重推出通過酶定向進化而來的新品逆轉錄酶：Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶（Cat#14614）。這款新型逆轉錄酶在穩(wěn)定性方面實現(xiàn)了顯著提升，同時其合成cDNA的產量、靈敏度也達到了更高的水平。此外，該產品由UCF.ME®超潔凈分子酶生產基地生產，整個生產過程對物料、環(huán)境、工藝、過程、質量等多環(huán)節(jié)進行嚴格把控，確保極低的背景菌gDNA殘留和核酸酶殘留，為實驗結果的準確性和可靠性提供了更有力的保障。

Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶能夠保證在低濃度模板情況下，搭配快速程序（逆轉錄2 min）,仍能擴增特異性靶標，且Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶和同類競品A相比，Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶對四個靶標的檢測Ct值及熒光增幅，均優(yōu)于競品A。對于低濃度樣本，也可實現(xiàn)精準檢測，達到早篩早診的目的。

圖4. Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶和競品A性能比較

使用Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶和競品A，搭配相同的反應buffer，將HRV靶標3種型別引探與所有試劑組分提前預混，在37℃條件下放置5天，與-20℃正常保存的試劑，同時檢測濃度為300 copies/µL的模板，結果顯示，競品A在熱加速處理后出現(xiàn)Ct值延后、熒光值降低的現(xiàn)象，而Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶在37℃加速5天后，與-20℃正常保存的試劑相比，擴增曲線峰形、熒光值、Ct值都沒有變化，Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶配制成的全預混體系穩(wěn)定性更高，可解決當前全預混體系在長期儲存過程中的性能難保持的問題。

圖5. Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶和競品A全預混穩(wěn)定性比較

Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶除了能夠保證在液體狀態(tài)下的性能，其對應無甘油酶用于凍干后，依然能保持其優(yōu)異性能。下圖為Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶和競品A分別配制成全預混體系凍干后性能測試結果，結果顯示Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶配制成全預混體系凍干后對靶標的檢測Ct值及熒光增幅，均優(yōu)于競品A。

圖6. Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶和競品A凍干后性能比較

在診斷試劑開發(fā)過程中，由于市場上的分子酶原料的質量良莠不齊，核酸殘留過高會影響擴增產物的特異性和準確性。經過實踐發(fā)現(xiàn)，分子診斷關鍵酶原料只有在核酸殘留極低（如Taq DNA聚合酶HCD ≤ 0.001copies/U）甚至達到無檢出的水平才能滿足日益提升的體外診斷試劑的性能需求。翌圣使用E. coli殘留檢測試劑盒檢測Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶，三批次Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶E. coli檢測結果均為未檢出，符合E. coli基因組DNA殘留＜0.02 copies/ 100 U標準，高標準的分子酶原料有助于提高樣本的檢測可靠性。

圖7. Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶E. coli基因組DNA殘留檢測結果

Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶能夠保證在不同濃度RNA模板投入時，均能獲得優(yōu)異的文庫產量，且得到的文庫大小一致，說明除RT-PCR/qPCR應用外，該酶同樣適用于NGS建庫。

圖8. Hifair UCF. ME® Advanced逆轉錄酶建庫性能驗證

除商業(yè)化逆轉錄酶外，翌圣還擁有逆轉錄酶突變體庫，可滿足不同應用場景的需求。目前，已有多家合作伙伴對翌圣鎂孚泰生物改造的逆轉錄酶突變體進行了試用，得到客戶的高度認可。如您對我們的逆轉錄酶突變體感興趣，可掃描下方二維碼聯(lián)系工作人員申請試用哦!

參考文獻：

[1] Georgiadis M M, Jessen S M, Ogata C M, et al. Mechanistic implications from the structure of a catalytic fragment of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase[J]. Structure, 1995, 3(9): 879-892.

[2] Lown P S, Cai J J, Ritter S C, et al. Extended yeast surface display linkers enhance the enrichment of ligands in direct mammalian cell selections[J]. Protein Engineering, Design and Selection, 2021, 34: gzab004.