谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）活性檢測(cè)試劑盒

（可見(jiàn)分光光度法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1115

產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px/GPX）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶。GPX能夠催化還原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的過(guò)氧化氫還原成無(wú)毒的羥基化合物。

GPX催化H₂O₂氧化GSH，產(chǎn)生GSSG，GSH能與DTNB生成在412nm處有特征吸收峰的化合物，412nm下吸光度的下降即可反應(yīng)GPX的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前加入5.5mL蒸餾水溶解；

2. 試劑二：臨用前加入6.6mL蒸餾水充分溶解待用；

3. 試劑三：液體置于試劑瓶?jī)?nèi)EP管中。臨用前按1μL試劑三：1mL蒸餾水的比例稀釋試劑三，現(xiàn)用現(xiàn)配；

4. 試劑四：瓶底若有結(jié)晶可50℃水浴溶解，此溶液為飽和溶液，若底部最終還有結(jié)晶，吸取上清使用即可；

5. 標(biāo)準(zhǔn)品：10mg還原型谷胱甘肽。臨用前加入1.62mL蒸餾水溶解為20μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、天平、臺(tái)式離心機(jī)、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP管。

操作步驟：

一、粗酶液的提取： 

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）:提取液體積(mL)為 1：5~10的比例（建議稱(chēng)取0.05g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)(如上清不清澈，再離心3min)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量10⁴個(gè)：提取液體積（mL）500~1000:1的比例，建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（率300w，超聲3 s，間隔7s，總時(shí)間3min）然后10000rpm，4℃，離心10min，取上清置冰上待測(cè)(如上清不清澈，再離心3min)。

3. 血清（漿）等液體：直接測(cè)定。

二、測(cè)定步驟： 

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 將20μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液用提取液稀釋為0.2μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。再吸取100μL標(biāo)準(zhǔn)溶液與400μL試劑四混勻待用，此標(biāo)準(zhǔn)液混合物的濃度為0.04μmol/mL。標(biāo)準(zhǔn)液混合物現(xiàn)用現(xiàn)配。

3. 樣本混合物：將150μL樣本與150μL試劑一混合后室溫放置5min。

4. 操作表：(在1.5mL離心管中依次加入下列試劑)

4000rpm常溫離心5min，取上清。

三：GPX活性計(jì)算： 

1. 抑制百分率的計(jì)算

抑制百分率＝(A對(duì)照管-A測(cè)定管) ÷（A對(duì)照管-A空白管）× 100%

盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)，越靠近50%越準(zhǔn)確。如果計(jì)算出來(lái)的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測(cè)定。如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測(cè)樣品。

2. GPX活性計(jì)算

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活力單位定義：每mg蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol GSH氧化定義為一個(gè)酶活力單位。

GPX (U/mg prot) =ΔA測(cè)定÷（△A標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V酶促÷（Cpr×V樣）÷T

=208×ΔA測(cè)定÷△A標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr。 

（2）按樣本鮮重計(jì)算

活力單位定義：每g樣品在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol GSH氧化定義為一個(gè)酶活力單位。

GPX (U/g 鮮重)= ΔA測(cè)定÷（△A標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V酶促÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=208×ΔA測(cè)定÷△A標(biāo)準(zhǔn)÷W。

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活力單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol GSH氧化定義為一個(gè)酶活力單位。

GPX (U/10⁴ cell)= ΔA測(cè)定÷（△A標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V酶促÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

=208×ΔA測(cè)定÷△A標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量。

（4）按液體體積計(jì)算

活力單位定義：每毫升液體在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol GSH氧化定義為一個(gè)酶活力單位。

GPX (U/mL)= ΔA測(cè)定÷（△A標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)）×1000×V酶促÷V樣÷T=260×ΔA測(cè)定÷△A標(biāo)準(zhǔn)。

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液混合物的濃度：0.04μmol/mL；V酶促：酶促反應(yīng)體系體積，1.3mL；V樣：樣本混合物中含有的樣本體積，0.05mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；細(xì)胞數(shù)量：以萬(wàn)計(jì)；W：樣品質(zhì)量，g；1000：換算系數(shù)，1μmol=1000nmol。

注意事項(xiàng)： 

1. 吸光度若大于1.2時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后進(jìn)行測(cè)定。

2. 建議一次不要做過(guò)多樣本以免檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響顯色，使測(cè)定不準(zhǔn)確。