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阿爾茨海默癥(AD)機(jī)制研究中的組織及細(xì)胞光學(xué)成像（下篇）

來(lái)源：徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司 2024年10月11日 10:14

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease, AD），俗稱“老年癡呆癥”，是一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，患者通常會(huì)出現(xiàn)以記憶力衰退、學(xué)習(xí)能力減弱為主的癥狀，并伴有情緒調(diào)節(jié)障礙以及運(yùn)動(dòng)能力喪失，極大地影響個(gè)人、家庭乃至社會(huì)的發(fā)展。目前，全球約有5000萬(wàn)人罹患AD。隨著人類平均壽命增長(zhǎng)、老齡化社會(huì)加劇，AD患病率也將不斷上升，預(yù)計(jì)到2050年AD患者將增加至1.5億以上。已有研究表明AD發(fā)病與代謝性改變相關(guān)，且AD具有很強(qiáng)的遺傳性。目前仍缺乏預(yù)防或治療AD的有效方法。組織及細(xì)胞相關(guān)的各類光學(xué)成像技術(shù)的應(yīng)用有助于AD病理學(xué)特征檢查、揭示病因機(jī)制，從而探索開(kāi)發(fā)新的治療策略。

以下將與大家分享徠卡Cell DIVE和LMD產(chǎn)品在研究AD蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用。

應(yīng)用Leica Cell DIVE多重成像進(jìn)行AD疾病腦空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析

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Cell DIVE多重成像結(jié)合Cell signaling Technology的IF/IHC 驗(yàn)證抗體，圍繞AD的病理標(biāo)志，檢查突觸及細(xì)胞的空間位置，并分割和聚類分析識(shí)別空間共定位的細(xì)胞群，例如疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物定義的細(xì)胞亞群。通過(guò)細(xì)胞類型特異性標(biāo)記結(jié)合多重組織成像，進(jìn)一步了解人類大腦的空間異質(zhì)性。

實(shí)驗(yàn)方法：

CST抗體經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的驗(yàn)證過(guò)程，以確保在FFPE組織上的性能。本研究中所有抗體均為直接偶聯(lián)抗體。（表格1）

組織從商業(yè)來(lái)源獲得 (BioChain，表格1) 。

成像：在Cell DIVE成像儀上使用四個(gè)通道加DAPI對(duì)載片進(jìn)行成像，自動(dòng)對(duì)焦，自動(dòng)校正和拼接。圖像采集在2周內(nèi)進(jìn)行。

圖像分析：使用AIVIA 13導(dǎo)入、融合和分析拼接圖像。應(yīng)用AI驅(qū)動(dòng)的模塊，對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行量化、表型分析。

圖4.1 A .成人對(duì)照和B. 成人阿爾茨海默病腦切片的多重成像，顯示了15個(gè)生物標(biāo)記物。C. 上: 神經(jīng)元標(biāo)記物的空間定位，以了解AD大腦外周與內(nèi)部表達(dá)的異質(zhì)性；下圖：通過(guò)像素分類器來(lái)分割A(yù)D腦中的所有表型標(biāo)記。D.以星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP、S100B)、小膠質(zhì)細(xì)胞(TMEM119、IBA1)、成熟神經(jīng)元(Enolase2)和阿爾茨海默病相關(guān)標(biāo)志物(TauGT-38、p-Tau217、P-Tau181和β-淀粉樣蛋白)特異性標(biāo)志物表達(dá)為特征的細(xì)胞表型。DAPI顯示為藍(lán)色。E. β-淀粉樣斑塊橫截面積(大小)直方圖。F.量化面積比，以估計(jì)阿爾茨海默癥大腦中標(biāo)記物表達(dá)與對(duì)照組相比的百分比變化。

圖4.2了解阿爾茨海默病大腦的神經(jīng)元空間布局。A . AD大腦中所有神經(jīng)元成分的相關(guān)圖，熱圖中顯示了所有測(cè)量值對(duì)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。B.與阿爾茨海默癥斑塊相關(guān)的空間圖像。箭頭表示β -淀粉樣蛋白陽(yáng)性斑塊段，20 um寬徑向圓顯示斑塊周圍聚集的鄰近細(xì)胞類型，標(biāo)記為GFAP+， S100B+， TMEM119+和IBA1+細(xì)胞。C.基于β -淀粉樣蛋白斑塊大小的AD大腦周圍的聚類揭示在較大斑塊周圍的幾個(gè)細(xì)胞群的富集以及基于與β -淀粉樣斑塊的相對(duì)距離，已確定的表型聚類。左下：基于與斑塊相對(duì)距離編碼的GFAP+細(xì)胞分割的代表性圖像。

圖4.3杏仁核中AD相關(guān)標(biāo)志物。AD杏仁核中神經(jīng)原纖維纏結(jié)(洋紅色)、斑塊中β淀粉樣肽Aβ沉積(白色)和GFAP+(綠色)星形膠質(zhì)細(xì)胞的定位。人AD大腦杏仁核內(nèi)側(cè)核相對(duì)沒(méi)有神經(jīng)原纖維纏結(jié)和β斑塊。在杏仁核的其他區(qū)域，如AD大腦的副基底區(qū)，纏結(jié)和β斑塊明顯上調(diào)。

應(yīng)用徠卡激光顯微切割LMD研究AD和輕度認(rèn)知障礙MCI患者腦淀粉樣血管病蛋白質(zhì)組的差異

腦淀粉樣血管病(CAA)以Aβ沉積在腦血管系統(tǒng)為特征。AD則和老齡化、腦出血有關(guān)，并導(dǎo)致認(rèn)知障礙。為了更好地了解分子機(jī)制，我們從年齡匹配的對(duì)照組(n=10)、輕度認(rèn)知障礙(MCI，n=4)，散發(fā)性AD (n=6)，利用LMD特異地分離病理組織，然后進(jìn)行無(wú)標(biāo)記定量質(zhì)譜分析。

樣本及免疫組化(IHC)：

FFPE 8um切片，放在PET膜玻片上，二甲苯和乙醇洗滌再水化，0.3% H2O2中孵育20分鐘，在10%山羊血清中封閉1小時(shí)，用4G8一抗(1:1000,biolgend #800711)在4℃下孵育一夜，洗滌后在生物素化小鼠二抗(1:1000,Vector實(shí)驗(yàn)室)中孵育1小時(shí)，然后用親和生物素過(guò)氧化物酶(Vector實(shí)驗(yàn)室)孵育1小時(shí)。切片用DAB溶液(ThermoFisher)孵育10分鐘，隨后用蘇木精(Sigma #MHS16)反染，并在封閉容器中風(fēng)干過(guò)夜。

LMD切割：

從n=10例對(duì)照 CAA(-)、n=4例MCI [CAA(+)和CAA(-)]和n=6例AD [CAA(+)和CAA(-)]病例中，以每例2 mm2的一致面積將灰質(zhì)中有管腔和血管壁的血管顯微切割到質(zhì)譜級(jí)水中(Thermo Scientifc)。包括大血管和毛細(xì)血管，不含輕腦膜和白質(zhì)中的血管。14000 g離心2 min，80℃保存。以上使用Leica LMD6500 10倍物鏡完成樣品切割。

圖5.切割CAA(+) (Aβ陽(yáng)性)血管和CAA(-) (Aβ陰性)血

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深入理解大腦疾病的空間異質(zhì)性，可通過(guò)多重免疫熒光組織成像的方式獲取更多空間蛋白的相關(guān)信息，Cell DIVE的循環(huán)染色方法和經(jīng)驗(yàn)證的370+抗體庫(kù)將會(huì)是您研究的得力工具。

LMD作為組學(xué)研究中樞，可以和其他空間成像技術(shù)相輔相成，并結(jié)合AI識(shí)別，提供從組織到單細(xì)胞水平樣本的分離收集，為下游發(fā)現(xiàn)新的biomarker、藥物靶標(biāo)開(kāi)發(fā)，疾病分型診斷、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供新觀點(diǎn)。

徠卡顯微系統(tǒng)，見(jiàn)微知著，

我們與您一起探索未知的腦世界！

參考文獻(xiàn)：

1. Spatial Proteomic Analysis of Alzheimer’s Disease Human Brain using Multiplexed Imaging.

2. Differences in the cerebral amyloid angiopathy proteome in Alzheimer’s disease and mild cognitive impairment. Acta Neuropathologica (2024) 148:9.

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