細(xì)胞組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性熒光定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

（中文版）

主要用途

細(xì)胞組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)二肽化合物底物z-FR-AMC，在組織蛋白酶L抑制劑的存在下，受到組織蛋白酶B的水解，釋放出熒光產(chǎn)物氨甲基，即采用熒光法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲(chóng)等）組織蛋白酶B（CATHEPSIN B）的特異活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

組織蛋白酶（CATHEPSIN），是一種木瓜酶（papain）類半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶體細(xì)胞器內(nèi)，在酸性環(huán)境下激活，切離各種目標(biāo)蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性，組織蛋白酶家屬約有十多種成員，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞外蛋白通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)行周轉(zhuǎn)中起著重要作用，同時(shí)也是啟動(dòng)和傳遞細(xì)胞凋亡信號(hào)的替代機(jī)制，以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又稱為CTSB，作為溶酶體的標(biāo)志性酶蛋白，可以使β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein）轉(zhuǎn)化為β-淀粉樣蛋白斑點(diǎn)（β-amyloid plaque）在抗原處理（antigen processing）、腫瘤轉(zhuǎn)移、骨再吸收、細(xì)胞內(nèi)或分泌性調(diào)節(jié)蛋白周轉(zhuǎn)、卵細(xì)胞成熟、細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用。細(xì)胞間接觸和細(xì)胞外基質(zhì)成分影響43kd組織蛋白酶原L轉(zhuǎn)化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結(jié)締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反應(yīng)。組織蛋白酶B異常，將導(dǎo)致阿茨罕默綜合癥（Alzheimer's disease）、食道腫瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患。基于人工合成的二肽化合物底物z-FR-AMC（z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin；乙酰苯丙氨酰精氨酰氨甲基），在組織蛋白酶L抑制劑Z-FY(t-Bu)-DMK的存在下，受到組織蛋白酶B的水解，釋放出熒光7-氨基-4-甲基（7-amido-4-methylcoumarin；激發(fā)波長(zhǎng)360nm；散發(fā)波長(zhǎng)460nm），來(lái)定量測(cè)定組織蛋白酶B的特異活性。組織蛋白酶B反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

緩沖液（Reagent C）        毫升

底物液（Reagent D）         微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）         微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)             1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent D）和 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

96孔板或比色皿：用于樣品熒光測(cè)定的容器

熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀：用于樣品熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品制備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升 裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長(zhǎng)360nm，散發(fā)波長(zhǎng)460nm，并置零

3． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管

4． 分別加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到2至5號(hào)管

5． 移取xx微升 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻

6． 小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻

7． 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻

8． 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻

9． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

1． 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升 底物液（Reagent D）

3． 加入xx微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育60分鐘

6． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）

7． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至6四次

8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位（RFU）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度（微摩爾/升）

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升 底物液（Reagent D）

3． 加入10微升待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育60分鐘

6． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得樣品相對(duì)熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）

7． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)AMC濃度

五、 計(jì)算樣品實(shí)際活性

六、 酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品

2． 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里

3． 分別加入xx微升 底物液（Reagent D）

4． 分別加入10微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

5． 輕輕搖動(dòng)96孔板

6． 在37℃溫度下孵育60分鐘

7． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)

8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度（微摩爾/升）

9． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)AMC濃度

10． 樣品實(shí)際活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定只需1次

4． 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融  

5． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

6． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

7． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定

8． 可以使用組織蛋白酶B抑制劑CA-074作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

9． 組織蛋白酶B單位活性定義為：在37℃，pH 5.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾二肽化合物底物z-FR-AMC所需的酶量作為一個(gè)活性單位

10． 本公司提供系列組織蛋白酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感