石蠟切片P16蛋白免疫熒光染色試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  石蠟切片P16蛋白免疫熒光染色試劑是一種旨在使用標(biāo)準(zhǔn)化的化學(xué)分離石蠟方法和免疫熒光技術(shù)，即通過抗P16多克隆抗體以及熒光染料綴合物二抗，通過熒光顯微鏡分析存檔中的石蠟包埋的組織切片中P16蛋白表達(dá)狀況的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于各種動物和人體組織石蠟包埋切片中P16目標(biāo)蛋白表達(dá)的熒光顯微鏡分析。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，反應(yīng)敏感，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細(xì)胞周期因子依賴性激酶抑制劑2A（Cyclin－dependent kinase inhibitor－2A；CDKN2A，又稱p16，抑制細(xì)胞周期因子依賴性激酶4和6，為腫瘤抑制因子，作用于細(xì)胞周期的調(diào)控。P16表達(dá)缺失，會導(dǎo)致腫瘤。免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence）是一種融合免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)為一體的標(biāo)記分析技術(shù)，通過使用抗體抗原反應(yīng)和示蹤熒光染料結(jié)合，定性和定位分析目標(biāo)抗原蛋白分子。免疫熒光技術(shù)分為直接法和間接法：前者使用示蹤熒光染料直接標(biāo)記在特定抗體上，直接檢測目標(biāo)抗原；后者使用第一抗體先于抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，然后運(yùn)用示蹤熒光染料標(biāo)記的第二抗體與第一抗原抗體復(fù)合物反應(yīng)，又稱為三明治方法，來檢測目標(biāo)抗原。石蠟切片免疫熒光染色，需要暴露組織抗原決定簇（epitope），便于抗體抗原充分反應(yīng)。石蠟切片的制備過程中，甲醛固定產(chǎn)生交聯(lián)，掩蓋了抗原，通過酶消化處理，可以充分暴露組織細(xì)胞中的抗原部位。其次，在去垢劑通透處理后，使抗體容易接觸到胞漿或細(xì)胞器的抗原。第三，借助山羊血清和牛血清白蛋白的作用，降低樣品非特異性背景噪雜，顯示反應(yīng)的特異性。 

產(chǎn)品內(nèi)容

  脫蠟液（Reagent A）                    300毫升（自備）

  補(bǔ)水液A（Reagent B）            100毫升

  補(bǔ)水液B（Reagent C）            100毫升

  補(bǔ)水液C（Reagent D）            100毫升

  補(bǔ)水液D（Reagent E）            100毫升

  清理液（Reagent F）                120毫升

  修復(fù)液（Reagent G）                  2毫升

  封阻液（Reagent H）                  4毫升

  一抗液（Reagent I）                  1毫升

  熒光液（Reagent J）                  1毫升

  抗淬滅液（Reagent K）               500微升

產(chǎn)品說明書                 1份

保存方式

保存  修復(fù)液（Reagent G）、  抗體液（Reagent I）、  熒光液（Reagent J）和  抗淬滅液（Reagent K）在—20℃冰箱里，嚴(yán)格避免反復(fù)凍融，其余的保存在4℃冰箱里；  熒光液（Reagent J）避免光照；有效保證3月

用戶自備

蓋玻片：用于封片孵育

小型染色缸：用于脫蠟的操作

烘箱：用于脫蠟處理

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于組織細(xì)胞熒光觀察

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 脫蠟處理

1． 取出10片待測的10微米厚的石蠟包埋的組織切片 

2． （選擇步驟）放進(jìn)80℃烘箱，孵育30分鐘

3． （選擇步驟）室溫下靜置15分鐘

4． 按下表依次放進(jìn)小染色缸里孵育

5． 小心移去切片上的  補(bǔ)水液D（Reagent E）

6． 小心加上200微升  清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

7． 室溫下孵育5分鐘

8． 小心移去切片上的  清理液（Reagent F）

二、樣品預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作：

1． 加入200微升  修復(fù)液（Reagent G）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

2． 室溫下孵育5分鐘

3． 小心抽去  修復(fù)液（Reagent G）

4． 空氣中晾干

5． 加入200微升  清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

6． 室溫下孵育5分鐘

7． 小心抽去  清理液（Reagent F）

8． 加入200微升  封阻液（Reagent H）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

9． 室溫下孵育60分鐘

10． 小心抽去  封阻液（Reagent H）

三、 樣品染色處理

1． 加入100微升  一抗液（Reagent I）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

2． 蓋上蓋玻片，室溫下孵育1小時(shí)（注意：避免氣泡；參見注意事項(xiàng)8）

3． 小心移去蓋玻片，抽去一抗液

4． 加入200微升  清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

5． 室溫下孵育5分鐘

6． 小心抽去  清理液（Reagent F）

7． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步4至6二次

8． 加入100微升  熒光液（Reagent J）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

9． 室溫下孵育30分鐘，避免光照（注意：避免氣泡）

10． 小心抽去熒光液 

11． 加入200微升  清理液（Reagent F）在切片上，鋪滿整個(gè)切片樣品表面

12． 室溫下孵育5分鐘

13． 小心抽去  清理液（Reagent F）

14． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步11至13二次

15． 加入50微升  抗淬滅液（Reagent K）

16． 蓋上蓋玻片或封片

17． 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為10次操作

2． 操作時(shí)須戴手套，以防污染

3． 石蠟包埋前，組織切片須用10％甲醛4℃條件下，固定16小時(shí)，否則造成樣品支離破碎

4． 所有操作在室溫下進(jìn)行

5． 用戶可以使用二甲苯替代  脫蠟液（Reagent A）

6． 每次更換試劑溶液時(shí)，保持切片面基本晾干。空氣中晾干狀態(tài)為沒有水滴，呈濕潤狀態(tài)，可見反光

7． 試劑溶液在切片表面時(shí)，避免有氣泡存在，同時(shí)確保鋪滿切片表面

8． 抗體孵育時(shí)，須避免光照

9． 一抗孵育，可以持續(xù)16小時(shí)

10． 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光顯微鏡觀察 

11． 本公司提供系列P16蛋白免疫熒光檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰