細胞NADPH氧化酶活性化學發(fā)光法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  細胞NADPH氧化酶活性化學發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在使用化學發(fā)光分子光澤精受到NADPH氧化酶催化產(chǎn)生的超氧陰離子O₂^-的還原，然后在其還原過程中釋放能量，由此測定樣品中特異性氧化還原酶（oxidoreductase）的活性，即采用發(fā)光探測儀（Luminometer）測定其相對冷光單位（RLU）的變化，以此進行測算酶活性的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細胞樣品（動物或人體）還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特異活性檢測。用于免疫、血液研究、蛋白組學、病理生理學等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。

技術背景

NADPH氧化酶，通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或還原型輔酶II氧化酶，是機體防御機制中的重要元素。NADPH氧化酶由6個亞體構成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5個phox（吞噬細胞氧化酶；phagocytic oxidase）。其中主要包含細胞膜嵌合蛋白質(zhì)分子（gp91phox、p22phox、flavocytochrome b558等），以及位在細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其最特征性的酶活性是超氧化物歧化酶敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。細胞膜上的NADPH氧化酶被激活，將還原型輔酶Ⅱ（NADPH）轉變?yōu)檠趸洼o酶Ⅱ（NADP），氧分子則獲得電子形成超氧陰離子O₂^-，由O₂^-又可生成H₂O₂和OH^－。其超氧陰離子產(chǎn)物具有殺死微生物的功能。NADPH氧化酶異常將導致慢性肉芽腫病（Chronic Granulomatous Disease；CGD）。基于底物NADPH，受到NADPH氧化酶的催化作用，產(chǎn)生超氧陰離子O₂^-，進而超氧陰離子將化學發(fā)光分子光澤精（lucigenin）還原，并釋放能量，通過發(fā)光探測儀（Luminometer；470nm波長）檢測，來測定NADPH氧化酶的活性。其反應方式為：   

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）         毫升

  裂解液（Reagent B）         毫升

  緩沖液（Reagent C）         毫升

  反應液（Reagent D）         微升

  陰性液（Reagent E）           毫升

  底物液（Reagent F）          毫升

  專性液（Reagent G）           微升

產(chǎn)品說明書                1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；  反應液（Reagent D）和  底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

微型臺式離心機：用于樣品制備

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應物孵育

專用測定杯或黑色96孔板：用于冷光測定的容器

化學發(fā)光儀：用于冷光分析

實驗步驟

測讀開始前，打開化學發(fā)光儀，設定儀器內(nèi)溫度為30℃預熱和運行程序（清洗步驟等），然后關掉實驗室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；  反應液（Reagent D）和  底物液（Reagent F）注意避光。然后進行下列操作。

一、樣品準備

1． 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升  清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升  裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管，置于冰槽里——此為細胞總蛋白

15． 同時加入xx微升  裂解液（Reagent B）到顆粒管

16． 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器

17． 在冰槽里用研磨棒勻化組織顆粒（約80下）

18． 轉移到到另一個新的預冷的1.5毫升離心管——此為細胞膜蛋白

19． 分別移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－   30030.1）

20． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準備

1． 從-70℃取出上述制備的待測樣品，置于冰槽里（注意：檢測前樣品須澄清；參見注意事項7）

2．   緩沖液（Reagent C）室溫下預熱

3． 設定好化學發(fā)光儀（溫度為30℃）：整合10秒，間隔1分鐘，測定5分鐘，并置零（注意：參見注意事項9）

三、 背景對照測定（選擇步驟）

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的專用測定杯

2． 加入xx微升  反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

4． 放進30℃培養(yǎng)箱里孵育3分鐘

5． 加入xx微升  陰性液（Reagent E）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進化學發(fā)光儀里

8． 整合10秒，測讀5分鐘，獲得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）讀數(shù)，此為背景空對照

四、樣品總活性測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的專用測定杯

2． 加入xx微升  反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

4． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

5． 加入100微升待測樣品（注意：300微克細胞膜蛋白或500微克細胞總蛋白；樣品須溶解；參見注意事項7）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進化學發(fā)光儀里，

8． 整合10秒，測讀5分鐘，獲得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）讀數(shù)，此為樣品總活性

五、樣品非特異活性測定（選擇步驟）

1． 準備1個1.5毫升離心管

2． 加入xx微升  專性液（Reagent G）

3． 加入100微升待測樣品（注意：300微克細胞膜蛋白或500微克細胞總蛋白；樣品須溶解；參見注意事項7）

4． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置5分鐘

5． 放進冰槽里備用

6． 移取xx微升  緩沖液（Reagent C）到新的專用測定杯

7． 加入xx微升  反應液（Reagent D）

8． 加入xx微升  底物液（Reagent F）

9． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

10． 加入上述冰槽里的xx微升含有  專性液（Reagent G）和待測樣品的溶液

11． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

12． 即刻放進化學發(fā)光儀里

13． 整合10秒，測讀5分鐘，獲得RLU（RELATIVE LIGHT UNIT）讀數(shù)，此為樣品非特異活性

六、 樣品活性分析

1．計算公式

2．繪制RLU讀數(shù)（Y軸）和時間（X軸）關系曲線

注意事項

1． 本產(chǎn)品為21次（10個樣本）操作，包括1次背景對照測定

2． 操作時，須戴手套

3．   反應液（Reagent D）和  底物液（Reagent F）注意避光

4． 測讀的所有步驟均須在暗室里進行

5． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

6． 背景測定和樣品非特異活性測定可以省略

7． 樣品檢測前，須溶解和澄清 

8． 加入樣品啟動反應后3秒內(nèi)即刻測定

9． 反應測定值隨著時間增加而逐漸升高，通常5分鐘達到峰值，并趨于穩(wěn)定；如果繼續(xù)升高，測定可以持續(xù)15分鐘

10． 測定值由低到高變化，表明有酶活性

11． 測定后，專用測定杯須清洗

12． 建議待測樣本總蛋白濃度為500微克/100微升（300微克膜蛋白+200微克總蛋白）或純化細胞膜蛋白為300微克/100微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒   30030.1）

13． 如果檢測純化細胞膜蛋白的酶活性，可以加入花生四烯酸（Arachidonic Acid）激活處理

14． 樣品實際活性是指超氧化物歧化酶敏感的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，去除其它干擾因素

15． 本公司提供系列氧化酶類技術產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確