siRNA轉(zhuǎn)染的常見問題解答

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如何優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染？轉(zhuǎn)染少量的siRNA為何很重要？在siRNA轉(zhuǎn)染過程中為何應當避免細胞毒性？本文收錄了與siRNA轉(zhuǎn)染相關的常見問題，并附上專家的解答，希望能對您的實驗有幫助。

Q：我該如何優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染？

A：在實驗室中建立RNAi和研究每一種新的細胞系時，應當優(yōu)化siRNA的轉(zhuǎn)染。HiPerFect Transfection Reagent Handbook中包含優(yōu)化的有用信息（www.qiagen.com/HB/HiPerFect）。在優(yōu)化實驗中，轉(zhuǎn)染效率可通過陽性對照（如AllStars Cell Death Control siRNA）的轉(zhuǎn)染來監(jiān)控。應當優(yōu)化的轉(zhuǎn)染因素包括：
試劑和siRNA的量

轉(zhuǎn)染時的細胞匯合度

分析前細胞和復合物的孵育時間

Q：轉(zhuǎn)染少量的siRNA為何很重要？

A：高濃度的siRNA轉(zhuǎn)染可能產(chǎn)生脫靶效應，即siRNA影響了部分同源或非同源基因的表達。研究表明，可能會對RNAi實驗產(chǎn)生誤導結(jié)果的脫靶效應可通過降低siRNA濃度而在很大程度上避免（1,2）。HiPerFect Transfection Reagent有助于siRNA的吸收，實現(xiàn)了低濃度下的基因沉默，而不損害knockdown的效率。

Q：在siRNA轉(zhuǎn)染過程中為何應當避免細胞毒性？

A：siRNA導入所引起的細胞毒性干擾了RNAi后的數(shù)據(jù)分析，因為表型分析不再可靠。影響數(shù)據(jù)分析的因素包括轉(zhuǎn)染試劑所引起的表型改變，壓力所引起的基因表達改變，以及不應當用于分析的死細胞的存在。

HiPerFect Transfection Reagent對細胞無毒性，不會引起液泡形成（這標志著細胞進程的破壞）。詳細的細胞周期和細胞形態(tài)學分析顯示mock轉(zhuǎn)染的細胞（只有HiPerFect Transfection Reagent）和未轉(zhuǎn)染的細胞之間無差異。

Q：順式轉(zhuǎn)染和反式轉(zhuǎn)染之間有什么差別？

A：在反式轉(zhuǎn)染的步驟中，siRNA先加在平板的孔中，然后才是轉(zhuǎn)染試劑。在復合物形成之后，加入細胞。順式轉(zhuǎn)染則相反，先在孔中加入細胞，然后才是復合物。反式轉(zhuǎn)染使用廣泛，特別對于高通量實驗，因為它容易自動化，轉(zhuǎn)染前siRNA可儲存在孔中，且使用了較少的材料，因為不需要在一塊單獨的板上開展siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復合物的形成。

順式轉(zhuǎn)染                                       反式轉(zhuǎn)染
第1步 細胞                                   第1步 核酸
第2步 轉(zhuǎn)染復合物                       第2步 HiPerFect Reagent
                                                        第3步 細胞

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