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對一個實驗室新手來講，提到ChIP，您可能沒聽過這個詞，他的全稱叫染色質免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation),今天就帶大家來學習一下CHIP實驗的相關知識，咱們主要從CHIP的定義、原理、步驟以及應用以下幾點給大家分析介紹，希望能幫助大家更好的做CHIP實驗
在活細胞狀態(tài)下，通過甲醛固定DNA-蛋白質復合物后，采用微球菌核酸酶（Micrococcal Nucleas）（注：早期使用的超聲已經被淘汰了，不推薦使用）隨機切斷DNA，形成一個個一定長度范圍內的染色質小片段，隨后通過抗原-抗體特異性結合反應富集、沉淀這些小片段，然后通過對NaC、蛋白酶K解除蛋白質和DNA的交聯(lián)，分離蛋白，純化DNA，最后采用PCR檢測DNA的序列信息，獲取更多信息。
從上面的原理就可以看出，ChIP實驗步驟大致可分6步：
（1）1%甲醛處理使蛋白質與 DNA 交聯(lián) ；
（2）細胞裂解，采用微球菌核酸酶消化形成染色質小片段；
（3）抗原-抗體反應，促進免疫沉淀反應；
（4）NaCl、蛋白酶 K 處理，解除DNA-蛋白交聯(lián)；
（5）DNA 純化回收；
（6）采用1.8%瓊脂糖凝膠電泳、RT-PCR對DNA作進一步分析。
甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白-DNA復合物，并沉淀---對沉淀下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。
基本的ChIP 實驗包括五個步驟（如下圖），分別是交聯(lián)、染色質片段化、免疫沉淀、DNA 回收和純化以及分析 DNA。由于實驗材料的不同，可能會造成在交聯(lián)和染色質片段化方面存在一些不同，需要不斷優(yōu)化條件，才能得到高質量的 DNA 從而進行后續(xù)的 ChIP 分析。
一般采用1% formaldehyde（甲醛）室溫交聯(lián)10-30分鐘，交聯(lián)的目的是為了建立蛋白質/DNA之間的穩(wěn)定共價連接，這個過程要注意一下幾點。（1）一定要使用新鮮甲醛溶液，因為甲醛容易被氧化，導致交聯(lián)不充分，在后續(xù)染色質剪切的時候則容易破壞蛋白和DNA的共價連接。（2）交聯(lián)的時間10-30分鐘，如果研究對象為轉錄因子等豐度比較高，和DNA結合也很穩(wěn)定，交聯(lián)10min即可，如果研究對象為轉錄輔因子等豐度比較低，也不是直接與DNA結合，則適當延長交聯(lián)時間至30min。
根據(jù)染色質剪切方式的不同，目前市面上提供兩種試劑盒，酶解法和超聲法的試劑盒。
酶解法則是在交聯(lián)處理之后，加入適量的核酸酶特異性的切割核小體，將核小體切割成以1個、2個……核小體為單位的片段。到這里，有些小伙伴可能就摩拳擦掌準備接下來的免疫沉淀了，但是小優(yōu)提醒您，酶解之后，樣品并沒有*切割好，還需要經過短暫的超聲處理，把細胞膜和核膜充分打碎，使染色質片段*釋放出來。
如果是超聲法，則比較簡單了，調整到合適的超聲功率，將樣品超聲處理適當?shù)臅r間就好了。在這個過程中要摸索好超聲的條件，過度超聲有可能破壞染色質完整性，會給ChIP實驗富集帶來負面影響，尤其是轉錄因子和輔因子。
向樣品中加入抗體將目的蛋白和連接的DNA拉下來。這個過程中引入protein G微珠，將目的蛋白和與它結合的DNA拉下來，這個過程中或多或少也會把其他雜蛋白一起拉下來，所以接下來進行高鹽和低鹽的洗脫，去掉雜質。
在這個過程中選擇合適的抗體對實驗結果至關重要。如果您需要做測序，則要選擇ChIP-seq級的抗體，如果只是做PCR，選擇ChIP級抗體即可。因為ChIP級抗體除了要結合*裸露的靶蛋白之外，還要結合因構象變化被DNA遮蔽的抗原表位，而ChIP-seq則需要檢測全基因組上大量的成千上萬的基因位點。所以要嚴格選擇相應級別的抗體。
用蛋白酶K解交聯(lián)，消化染色質的蛋白質組分和DNA之間的連接，然后經過DNA純化柱對樣品進行純化。
純化好的DNA進行PCR或者測序分析。
利用 ChIP 檢測特定的轉錄因子在基因組中的結合位置及序列，可發(fā)現(xiàn)下游基因的順式調控元件，從而幫助完善轉錄因子參與的分子通路。
ChIP 可用于檢測 RNA 聚合酶II以及其他轉錄組分的結合位點，從而發(fā)現(xiàn)啟動子和增強子的序列，同時也可能發(fā)現(xiàn)新的轉錄調控機制。
ChIP 研究在組蛋白密碼的發(fā)現(xiàn)和表征方面起著關鍵的作用，通過 ChIP 可發(fā)現(xiàn)組蛋白特異性修飾的水平，同時也可明確組蛋白的修飾對基因的調控作用。
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