HL50097.2 v.A   組織鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

 組織鈣離子濃度比色法定量檢測試劑是一種旨在通過鄰甲酚酞絡(luò)合酮，在堿性條件下與鈣離子反應(yīng)產(chǎn)生紫藍色復(fù)合物，在分光光度儀下通過吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織（動物、人體等）裂解萃取樣品中總鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。鄰甲酚酞絡(luò)合酮（o－ cresolphthalein complexone；CPC）比色法是一種穩(wěn)定、簡便、準(zhǔn)確的鈣檢測技術(shù)。鈣與鄰甲酚酞絡(luò)合酮， 在堿性條件下反應(yīng)產(chǎn)生紫藍色復(fù)合物，在分光光度儀下通過吸光峰值的變化（波長570nm），來定量測定組織鈣的總濃度。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

e

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B） 毫升

 緩沖液（Reagent C） 毫升

 反應(yīng)液（Reagent D） 毫升

 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E） 微升

產(chǎn)品說明書 1 份

保存方式

保存在 4℃冰箱里， 緩沖液（Reagent C）、 反應(yīng)液（Reagent D）和  標(biāo)準(zhǔn)液

（Reagent E）避免光照，有效保證 6 月

用戶自備

15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5 毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和樣品保存的容器

微型臺式離心機：用于樣品制備比色皿：用于反應(yīng)的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1. 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定組織重量

2. （選擇步驟）放進預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

3. （選擇步驟）加入適量的（500 毫克組織需要xx 毫升） 清理液（Reagent A）清洗 1 次

4. 移入到一個液氮凍存管

5. 即刻放進液氮罐過夜

6. 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

7. 放進一個 15 毫升錐形離心管

8. 加入預(yù)冷的xx 微升  裂解液（Reagent B）

9. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管10．強力渦旋震蕩 30 秒，充分混勻

11. 置于冰槽里孵育 30 分鐘，期間每 10 分鐘強力渦旋震蕩 30 秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/span>）

12. 放進 4℃微型臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

13. 小心移取xx 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

14. 移取 10 微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－

30030.1）

15. 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作二、 測定準(zhǔn)備

1. 準(zhǔn)備好上述制備的待測樣品，置于冰槽里備用

2. 設(shè)定好分光光度儀：波長 570nm，并置零

3. 準(zhǔn)備好 5 個 1.5 毫升離心管，標(biāo)記為 1 至 5 號管

4. 分別加入xx 微升  緩沖液（Reagent C）到 2 至 5 號管

5. 移取xx 微升  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）到 1 號管，混勻

6. 小心移取xx 微升 1 號管的  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到 2 號管，混勻

7. 小心移取xx 微升 2 號管稀釋的  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到 3 號管，混勻

8. 小心移取xx 微升 3 號管稀釋的  標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到 4 號管，混勻

9. 將 1 至 5 號管放進冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

三、比色測定

1. 移取xx 微升  緩沖液（Reagent C）到新的 1 毫升比色皿

2. 加入xx 微升  反應(yīng)液（Reagent D）

3. （選擇步驟）放進分光光度儀，置零

4. （選擇步驟）取出比色皿

5. 加入xx 微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品

6. 上下傾倒數(shù)次，混勻

7. 室溫下孵育 5 分鐘，避免光照

8. 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)（OD）

9. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為吸光單位（OD）；橫座標(biāo)（X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)鈣濃度（毫摩爾/升）

10. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)鈣濃度

11. 計算樣品實際鈣濃度

【根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)鈣濃度（毫摩爾/升） X 樣品稀釋倍數(shù)】＝毫摩爾/升

注意事項

1. 本產(chǎn)品為 25 次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液

2. 操作時，須戴手套

3. 避免使用EDTA 等處理樣品

4. 建議樣品保存在－70℃冰箱里

5. 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)液測定只需 1 次

6. 孵育反應(yīng)完成后即刻進行比色測定

7. 如果樣本鈣離子過低，可以增加孵育時間至 30 分鐘

8. 比色測定后，比色皿須清洗*

9. 如果用戶沒有匹配的濾波器，可以使用 570nm 至 600nm 之間的任一波長

10. 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

11. 檢測敏感度在 5 微摩爾至 4 毫摩爾鈣濃度范圍

12. 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感