實時熒光定量PCR

1996年，實時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR) 由美國Applied Biosystems公司首先推出，所謂Real-time qPCR是指在PCR反應中加入熒光基團，通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及信號強弱的變化，即時分析目的基因的初始量，該技術的發(fā)明實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。

熒光化學物質

目前根據(jù)Real-time qPCR所使用熒光化學物質不同，將其分為熒光染料和熒光探針兩類。

熒光染料

熒光染料也稱DNA結合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結合，游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號，但結合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產物的增加，PCR產物與染料的結合量也增大，其熒光信號強度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。

熒光染料的優(yōu)點：

1. 使用簡便；
2. 可以與任何PCR產物結合；
3. 價格便宜；

熒光染料的缺點：

1. 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA
2. 引物二聚體會影響檢測的敏感性
3. 非特異性產物會影響結果的敏感性

引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別，進而通過PCR引物的設計和反應條件的優(yōu)化得以解決。

總的來說，SYBR Green I方法是一種最基礎也最cy的Real-time qPCR實驗手段。

熒光探針

Real-time qPCR中最cy的熒光探針為TaqMan探針，其基本原理是依據(jù)目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的探針，該探針的5'端標記熒光基團，3'端標記淬滅基團。

正常情況下兩個基團的空間距離很近，熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時，引物與該探針同時結合到模板上，探針的結合位置位于上下游引物之間。

當擴增延伸到探針結合的位置時，Taq酶利用5'外切酶活性，將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來，從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產物的數(shù)量成正比，因此，根據(jù)PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。

TaqMan探針技術解決了熒光染料與非特異性擴增結合的問題，反應結束后無需通過熔解曲線檢測，縮短了實驗時間。

TaqMan探針技術的優(yōu)點：

1. 熒光背景低；
2. 敏感性高；
3. 雜交穩(wěn)定性高；
4. 熒光光譜分辨率好；
5. 特異性高。

TaqMan探針技術的缺點：

1. 成本高；
2. 設計難度大；
3. 只能用于檢測產物長度低于150bp的反應。

由于TaqMan探針的高特異性，可用于等位基因的辨別，特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。

Real-time qPCR技術的定量原理

擴增曲線

在Real-time qPCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號，隨著反應的進行，監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線，即為擴增曲線。

熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。

在Real-time qPCR擴增早期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化，此時即為基線期。

PCR反應過程中產生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的，隨著反應循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板，從而進入“平臺期”。在該時期，擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的終產物量與起始模板量之間無線性關系，所以根據(jù)最終的PCR產物量不能計算出初始模板量。

只有在熒光信號的指數(shù)增長期，PCR產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。

熒光閾值

為了便于對所檢測樣本進行比較，首先需設定一個熒光信號的閾值，熒光閾值是在擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光閾值設置為3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，但實際應用時要結合擴增效率、線性回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮。

通常熒光閾值都是Real-time qPCR儀器自動設置，如無特殊情況，無需更改。

循環(huán)閾值

循環(huán)閾值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR擴增過程中擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時所經過的擴增循環(huán)次數(shù)，Ct值與熒光閾值有關。

一般Ct值位于指數(shù)增長期的開始階段，此時樣品間細小物差尚未放大且擴增效率也相對恒定，因此該Ct值具有ji好的重復性，盡管平臺期的DNA拷貝數(shù)波動很大，Ct值卻是相對固定的。

定量原理

對于一個理想的Real-time qPCR反應：

對于一個非理想的Real-time qPCR反應：

其中，n為擴增反應的循環(huán)次數(shù)，Xn為第n次循環(huán)后的產物量，X0為初始模板量，E%為擴增效率。

在Real-time qPCR中，在擴增產物達到熒光閾值線時：

其中，XCt為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量，在熒光閾值設定以后，XCt為一個常數(shù)；

將上述公式兩邊取對數(shù)，并換算可得如下公式：

即Ct值與lgX0呈負相關，據(jù)此即可計算出樣本中所含的初始模板量。

Real-time qPCR的優(yōu)點

1. 特異性好，使用特異性探針對定量分子進行識別，具有很高的準確性。
   同時，靶序列由引物和探針雙重控制，假陽性低。
2. 靈敏度高，Real-time qPCR技術是綜合了PCR技術、熒光標記技術、激光技術、數(shù)碼顯像技術為一體的技術，因此它的檢測靈敏度很高。
3. 準確性高、檢測范圍寬，由于熒光信號的產生和每次擴增產物成線性對應的關系，通過熒光信號的檢測可以直接對產物進行定量；定量范圍可在0-1010拷貝/毫升。
4. 操作簡單、安全、無污染，擴增和檢測可以在同一管內進行，不需要開蓋，不易污染，同時擴增和檢測一步完成，不需要后期處理，不再需要擔心放射性污染。
5. 速度快、通量高，可在2-3小時內完成96個樣品的定量分析。