熒光定量pcr原理和步驟

熒光定量pcr是一種新興的pcr技術(shù)，它通過熒光染料或熒光標(biāo)記的具有特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤，可以實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度，也被稱為實時熒光定量pcr。

一、熒光定量pcr特點和優(yōu)勢

1、傳統(tǒng)定量PCR方法

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，Z終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

2、熒光定量pcr vs 傳統(tǒng)定量PCR

熒光定量pcr是從傳統(tǒng)基于凝膠的低通量PCR技術(shù)發(fā)展而來的高通量的熒光分析技術(shù)，是一種實時定量PCR方法。

實時定量PCR是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進行分離。目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。

不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。

二、熒光定量pcr的兩種方法類型

熒光定量pcr常用的兩種方法分別為：Sybr green（熒光染料摻入法） 和Taqman probe （探針法）

1、熒光染料摻入法

熒光染料摻入法原理是：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。

此方法適用：

a、通用性好,不需要設(shè)計探針,方法簡便,省時,價格低廉。 

b、靈敏度高：使用SYBR可使熒光效果增強到1000倍以上 

d、專一性要求不高的定量PCR檢測。 

e、通用型方法，在國內(nèi)外科研中普遍使用。

f、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測 

2、探針法

探針法熒光定量pcr原理是：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步 

此方法適用：

a、適用于擴增序列專一的體系的檢測。 

b、具有高適應(yīng)性和可靠性，實驗結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高。 

c、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。 

d、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計條件都不能解決。 

e、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。 

f、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫,生物制品的鑒定。

三、實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

熒光定量PCR是1996年由美國Applied Biosystems 公司推出的。經(jīng)過二十年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷各型肝炎、艾滋病、禽 LIU感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價；臨床疾病診斷、禽LIU感、新城疫、口蹄疫、豬瘟等動物疾病檢測；食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因研究等食品安全操作。等等各個領(lǐng)域。

1、基因分型

例如SNP檢測，甲基化檢測等。

SNP檢測是確定一對染色體的每種基因的兩個拷貝，哪種點突變在這兩個拷貝中存在，因此利用熒光定量PCR方法，并配合芯片技術(shù)可以快速靈敏的檢測到SNP結(jié)果。

DNA甲基化是Z早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達。

2、基因表達差異分析

例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證 。

基因表達差異通常是指一個基因在兩個條件中表達水平的檢測值在排除實驗、檢測等因素外，達到一定的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義，同時也具有生物學(xué)意義。

3、DNA 或RNA 的定量分析

包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。基因失活是指利用反義技術(shù)，使非正?；蚧蛴泻虿槐磉_或降低表達活性，以達到治療某些特定疾病的目的。