產(chǎn)品說(shuō)明

GV3101 菌株為 C58 型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因 rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌

株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型 Ti 質(zhì)粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有 vir 基因 (vir 基因是

T-DNA 插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的 T-DNA 轉(zhuǎn)移功能被破壞，但

可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體 T-DNA 順利轉(zhuǎn)移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型 Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：gent，

賦予 GV3101 菌株慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。本公司生產(chǎn)

的 GV3101 化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301 質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA。

常規(guī)操作方法

1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。

2. 每 100 μl 感受態(tài)加 1 μg（體積不大于 10 μl）質(zhì)粒 DNA，用手管底混勻，依次于冰上靜置 5 分鐘、

液氮 5 分鐘、37℃水浴 5 分鐘、冰浴 5 分鐘。

3. 加入 700 μl 無(wú)抗生素的 LB 或 YEB 液體培養(yǎng)基，于 28℃振蕩培養(yǎng) 2~3 小時(shí)。

4. 6000 rpm 離心一分鐘收菌，留取 100 μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的 LB 或 YEB

平板上，倒置放于 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2-3 天

（當(dāng)平板只含有 50 μg/ml kan 時(shí)，28℃培養(yǎng) 48 h 即可；平板中同時(shí)加入 50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時(shí)，

需 28℃培養(yǎng) 60 h；如果使用的平板含有 50 μg/ml rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90 h）。

注意事項(xiàng)

1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的 1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，

轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于 25 μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司 GV3101

感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有 50 μg/ml kan，若所用平板含有 20 μg/ml rif 則轉(zhuǎn)化效率降低到 1/2。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止 Ti 質(zhì)粒丟

失，但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti 質(zhì)粒丟失的概率極低 (可

以忽略)。