細(xì)胞凋亡內(nèi)容前面也介紹了幾篇內(nèi)容，相信大家對(duì)細(xì)胞凋亡的基本概念、細(xì)胞凋亡不同時(shí)期的主要特征及常用檢測(cè)方法都有了一定程度的了解。本期，將為大家講解TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理和經(jīng)驗(yàn)總結(jié) 。

一、TUNEL法的實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。由此，TUNEL成為了檢測(cè)DN段化（細(xì)胞凋亡）的方法。（以下是TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光））

 TUNEL檢測(cè)：使用10 U/ml Dnase處理Hela細(xì)胞10分鐘

二、TUNEL實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵步驟

1.充分脫蠟和水化。脫蠟可以先 60ºC 20 min，再用使用二甲苯兩次 5-10 min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分、均勻；

2.把握好細(xì)胞通透的時(shí)間。一般根據(jù)切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時(shí)間，常用 10-30 min，幾 μm 切片用短時(shí)間；幾十 μm 切片用長(zhǎng)時(shí)間，通過摸索達(dá)到既不脫片，有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內(nèi)。

3.適當(dāng)延長(zhǎng) TUNEL 反應(yīng)液的時(shí)間。一般是37ºC 1 h，你也可以根據(jù)你的凋亡損傷程度，選擇更長(zhǎng)的時(shí)間，可長(zhǎng)至 2 h，但要結(jié)合你終的背景著色。

4.DAB 顯色條件的選擇。一般 DAB 反應(yīng)10 min 左右，結(jié)合鏡下控制背景顏色，長(zhǎng)不超過 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃紅色），不利于辨認(rèn)棕褐色，我不太喜歡。

5.PBS 的充分清洗。我個(gè)人認(rèn)為，在 TUNEL 反應(yīng)后和酶標(biāo)反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴(yán)格，可增加次數(shù)達(dá) 5 次，因?yàn)檫@些清洗直接決定后切片的非特異性著色。

6. 此外，內(nèi)源性 POD 的封閉也十分關(guān)鍵。對(duì)于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織，我的經(jīng)驗(yàn)是適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間和升高過氧化氫的濃度，可以達(dá)到很好的封閉效果，且不影響終的特異性染色。

三、細(xì)胞通透的時(shí)間選擇

1.蛋白酶 k 的目的是通透細(xì)胞膜和核膜，從而使反應(yīng)試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高陽(yáng)性率。但濃度過高或孵育時(shí)間太長(zhǎng)容易脫片，只要不脫片，好像影響不大，其作用類似與 TritonX100 等細(xì)胞通透劑。

2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10 mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K緩沖液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分裝成小份，用完一支再用下一支，-20ºC保存 1 個(gè)月應(yīng)該沒問題的（重復(fù)拿的那支），而一直冷凍的至少可以用半年以上。

3. 蛋白酶K反應(yīng)時(shí)間一般為10-30 min，具體時(shí)間長(zhǎng)短與切片厚薄有關(guān)，4 μm左右的片子可以用 10 min，但30 μm左右的可用30 min，終通過摸索時(shí)間。過長(zhǎng)易脫片、過短起不到通透效果。

關(guān)鍵試劑操作條件

DAB 顯色反應(yīng)大約需要10 min，要控制好反應(yīng)時(shí)間，勿使背景顏色過深。具體的可能還是得根據(jù)切片組織來源和切片厚度、試劑盒種類不同來摸索一下。

蛋白酶K工作液處理時(shí)間、溫度須在范圍內(nèi)摸索，溫度過高，時(shí)間過長(zhǎng)，易破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。

DNase 1 一般室溫，10 min 即可。

四、如何減弱非特異性染色

若是肝臟或腎臟，因富含內(nèi)源性過氧化物酶，需要增加過氧化氫濃度和延長(zhǎng)孵育時(shí)間。其他還可以加強(qiáng)滅活、縮短 DAB 孵育時(shí)間、PBS 充分清洗，注意鏡下把握好著色。

Tips

1.濕盒用帶蓋方盤，里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片，使用時(shí)稍加水即可。

2.英文說明書中對(duì)組織細(xì)胞通透這一步中，加了“對(duì)難處理的組織的處理”，意思是用常規(guī)方法處理（如蛋白酶 K)后，應(yīng)該陽(yáng)性而做不出陽(yáng)性時(shí)，可用微波修復(fù)。

3.復(fù)染的目的是為了襯托組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，以利于結(jié)果分析，石蠟切片常用蘇木素，核染成蘭色，冷凍切片常用甲基綠，核染成綠色。

4.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4、KH2PO4配制，現(xiàn)在有賣的，自己加蒸餾水稀釋后即可用，很方便，也不貴。

5.蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封閉液。

（本文轉(zhuǎn)自每日生物評(píng)論）