RNA干擾實驗

（如需詳細資料，請聯(lián)系超博科技小凌）

一、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法

【實 驗 原 理】

磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復合物的一種將DNA導入真核細胞的轉(zhuǎn)染方法。磷酸鈣

有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結(jié)合。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲

作用進入靶細胞，被轉(zhuǎn)染的DNA可以在細胞內(nèi)進行瞬時表達，也可整合到靶細胞的染色體

上從而產(chǎn)生不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆。該方法可廣泛用于轉(zhuǎn)染許多不同類型的細胞。 

【儀器、材料和試劑】

（一）儀器、用具

CO2培養(yǎng)箱、10cm細胞培養(yǎng)平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml錐形管、燒杯、量筒

等。 

（二）材料

呈指數(shù)生長的真核細胞BALB/c 3T3

CsCl純化的表達質(zhì)粒DNA

（三）試劑

1．*培養(yǎng)液 

DMEM 90ml

FCS 10ml

2．2M CaCl2，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?/span>

3．2×HEBS (g/500ml)

NaCl 8.0

KCl 0.38

Na2HPO4.7H2O 0.19

HEPES 5.0

葡萄糖 1.0

用NaOH調(diào)pH至6.95，過濾除菌后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>

【方法與步驟】

1．在10cm的培養(yǎng)板上接種1×106個BALB/c 3T3細胞

第二天進行轉(zhuǎn)染

2．準備CaPO4沉淀

2.1 準備兩組試管

在A管中加入： 15μg質(zhì)粒DNA

69μl 2M CaCl2 

460μl重蒸水

在B管中加入： 550μl 2×HEBS 

2.2 用巴斯德吸管將 A 管中的溶液緩慢地逐滴加入在 B 管中，同時用另一吸管吹打 B 管溶

液，整個過程需緩慢進行，至少需持續(xù)1～2min。 

2.3室溫靜置30min，出現(xiàn)細小顆粒沉淀。

3. 小心地將沉淀逐滴均勻地加入培養(yǎng)細胞的10cm平板中，輕輕晃動（此過程需盡快完成）。

4. 在5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞2-6 hr。

5. 除去培養(yǎng)液，加入10ml*培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞1-6天（依具體情況而定）。

6. 收集細胞進行基因活性的檢測，或分散接種到其他培養(yǎng)皿中進行選擇培養(yǎng)。

【注 意 事 項】

1．在整個轉(zhuǎn)染過程中要保持無菌操作。

2．在實驗中使用的各種試劑都必須小心校準，保證質(zhì)量。

3．質(zhì)粒DNA 需CsCl純化，乙醇沉淀后的DNA應保持無菌，在無菌水或Tris- EDTA中

溶解。

4．沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2

溶液時需用空氣吹打，以確保形成盡可能細小的沉淀物，因為成團的DNA不能有效地黏附

和進入細胞。

二、電穿孔和電融合技術(shù)

[實驗原理]

當細胞置于非常高的電場中，細胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴散進細胞內(nèi)，這

一現(xiàn)象稱為電穿孔。運用這一技術(shù)，許多物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、藥物、抗體和

熒光探針都能載入細胞。作為一種基因轉(zhuǎn)導方法，電穿孔已被廣泛用于各種細胞類型，包括

細菌、酵母、植物和動物細胞；而且，它還能作為注射方法（稱為電注射），把各種外源物

質(zhì)引入活細胞。與其他常用的導入外源物質(zhì)的方法相比，電穿孔具有很多優(yōu)點。首先，不必

象顯微鏡那樣使用玻璃針，不需要技術(shù)培訓和昂貴的設(shè)備，可以一次對成百萬的細胞進行注

射。第二，與用化學物質(zhì)相比，電穿孔幾乎沒有生物或化學副作用。第三，因為電穿孔是一

種物理方法，較少依賴細胞類型，因而應用廣泛。實際上，對大多數(shù)細胞類型，用電穿孔法

基因的轉(zhuǎn)移效率比化學方法高得多。 

除了能使細胞膜具有通透性，讓外界的分子擴散入胞液中以外，高強度的電場脈沖也能引起

細胞融合，這一現(xiàn)象叫做電融合。然而，在用電脈沖融合前必須使細胞相互緊密接觸，這一

電融合方法在原生質(zhì)融合制取雜交植物，胚胎細胞相互融合制備動物克隆方面非常有用，尤

其在制取雜交瘤細胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個實驗室已證明使用電場電融合效率

比常規(guī)的化學融合方法高10到100倍，近來，貼壁細胞的電融合還被用來研究細胞融合時

細胞的骨架成分和細胞器的動力學重排。

[儀器、材料和試劑]

（一）儀器：

脈沖發(fā)生器，樣品池：一個盛細胞的容器和兩個平行的金屬電極，CO2 培養(yǎng)箱，離心機，

顯微鏡，微量移液器，鑷子，剪刀，三角瓶，吸管，毛細管，離心管等。 

（二）材料：

（三）試劑：

穿孔介質(zhì)（PM）：15mmol/L磷酸鉀 1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖（或甘露醇）

10mmol/L HEPES 調(diào)節(jié)pH至7.3

融合介質(zhì)（FM）：1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇 2mmol/L HEPES 調(diào)節(jié)pH 至

7.3

[方法與步驟]

一．懸浮細胞的電穿孔法：

1電穿孔進行基因轉(zhuǎn)移

電穿孔可用于將多種不同類型的分子載入活細胞中，操作步驟非常相似。以下我們用基因轉(zhuǎn)

移作為例子。載入其他的分子可按以下相同步驟進行，只需把外源DNA換頁所需分子即可。

1.1 使細胞在適宜的培養(yǎng)基中生長，用胰酶處理，收獲對數(shù)生長中期的細胞，并用腺酶處

理。

1.2 在穿孔介質(zhì)（PM）中至少洗一次。洗細胞時，在臺式離心機上1000rpm離心3分鐘，

使得懸浮細胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介質(zhì)中重新懸浮細胞。

1.3 計數(shù)細胞，在PM 中，濃縮細胞為大約1千萬細胞/ml。

1.4 將 DNA 加到細胞懸液中，充分混合，使 DNA 均勻分散，用吸管吸一定體積的細胞

-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。

1.5 在電穿孔裝置上設(shè)置輸出電壓和脈沖寬度（脈沖寬度是指數(shù)衰減函數(shù)的時間常數(shù)，即

τ=RC，C 是電容，R 是樣品的電阻）。假如設(shè)備是 CD 脈沖型發(fā)生器，設(shè)定電容和并聯(lián)電

阻，以達到合適的τ值。 

1.6 將小池放進盛樣品的池中，啟動電穿孔裝置，供給所需的電脈沖。

1.7 電處理后，向小池加1ml普通培養(yǎng)基，將細胞混合液從小池轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)容器（培

養(yǎng)皿或培養(yǎng)孔）中，再加入一些培養(yǎng)基使之后的培養(yǎng)基體積適量。然后，將樣品細胞放回孵

育箱中使之在正常條件下生長。

1.8 在測定轉(zhuǎn)移基因的表達量前電穿孔細胞各自培養(yǎng)的時間不同。

2檢測電穿孔效率和細胞存活率

2.1 除用羅丹明偶聯(lián)葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替 DNA 外，將羅丹明偶聯(lián)葡聚糖

引入目標細胞的方法如前所述。

2.2 電穿孔后，用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。 

2.3 電穿孔后30min，向細胞懸液中加30μl臺盼藍，孵育2min，然后用培養(yǎng)基洗滌。

2.4 在1000rpm下離心3min，收集細胞，將細胞重懸于PM中，終體積100μl。

2.5 將一滴細胞液（30μl）置于干凈載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測細胞，測定

攝取熒光標記葡聚糖的百分數(shù)。

2.6 在亮視野鏡片下，死細胞可因染成藍色檢測出（攝取了臺盼藍），測定細胞存活的百分

數(shù)。

2.7 在各種電場設(shè)定值下重復實驗，畫出攝取葡聚糖率和細胞存活率對電穿孔參數(shù)的曲線。

這一曲線就將顯示對特定細胞類型電穿孔的zui優(yōu)條件。

二．懸浮生長細胞的電融合 

融合懸浮細胞的步驟與電穿孔的很類似，只是在進行高強度的電場脈沖前后，必須用低幅、

高頻電場使細胞排成一條鏈。

1 用融合介質(zhì)（FM）洗懸浮細胞兩次，然后懸于 FM 中。洗滌細胞時，在臺式離心機上

1000rpm下離心3分鐘，得到細胞沉淀，棄去上清液將細胞懸于新鮮FM介質(zhì)中。

2 將懸浮細胞轉(zhuǎn)移到相應的融合室內(nèi)。假如要使兩種不同的細胞彼此融合，轉(zhuǎn)移前要充分

混合。

3 啟動介電電泳場，其振幅通常小于200V/cm，頻率在2MHz以內(nèi)，用顯微鏡檢測細胞是

否排成一條鏈，調(diào)節(jié)振幅和頻率以達到zui佳效果。

4 讓介電電泳場開約 1 分鐘后關(guān)掉，立即應用融合脈沖，其振幅數(shù)量級為 1kV/cm。脈沖

寬度小于1ms。在進行融合脈沖后立即再次啟動介電電泳場，常規(guī)讓其開啟約2分鐘。

5 關(guān)掉介電電泳場，讓細胞在樣品池中靜置10分鐘。

6 去掉FM，用普通培養(yǎng)基再次洗滌細胞。

7 將細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，加入普通培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱一般條件下培養(yǎng)。

[注意事項]

1 Zui優(yōu)組分依使用的特定細胞種類而有明顯的變化。如果努力優(yōu)化電壓和脈沖寬度電穿孔

結(jié)果仍不令人滿意，就應嘗試改變穿孔介質(zhì)。

2 影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細胞狀態(tài)有關(guān)，為達到zui高效率，必須收集對數(shù)生

長中期的細胞。

1.純化siRNA 

在轉(zhuǎn)染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗

脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注

意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。 

2.避免RNA酶污染 

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，

所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非

常重要。

3.健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復性 

通常，健康的細胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。

為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細胞，否則細胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。 

4.避免使用抗生素 

抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條

件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到zui佳轉(zhuǎn)染效果。

5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑 

針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實

驗的成功至關(guān)重要。 

6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件 

對大多數(shù)細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細胞

（同樣適合實驗靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細胞的降

低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。

7.通過標記siRNA來優(yōu)化實驗 

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標記的siRNA還可用作siRNA

胞內(nèi)定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導入了siRNA的細胞，將轉(zhuǎn)染

與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。

RNAi研究的一般技術(shù)路線是：