原創(chuàng)： niwanmao 流式中文網(wǎng) 昨天

線粒體是細(xì)胞代謝的重要介質(zhì)，是活性氧（ROS）的產(chǎn)生者和靶點(diǎn)，是ATP水平和鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑，也是參與氨基酸、脂質(zhì)和核苷酸合成的生物合成途徑的樞紐。

線粒體存在于所有細(xì)胞中，它們的大小、形狀和數(shù)量不同，這取決于細(xì)胞、基礎(chǔ)組織和其他一些因素的代謝需求?？紤]到它們?cè)诩?xì)胞和機(jī)體功能中的關(guān)鍵作用，在許多遺傳和非遺傳疾病以及癌癥和衰老中觀察到線粒體（mt）功能障礙并不奇怪。在絕大多數(shù)情況下，mt功能障礙的顯著特征包括mt膜電位（mtmP）、mt質(zhì)量和氧化還原電位的變化。

流式細(xì)胞儀可以快速監(jiān)測(cè)完整細(xì)胞中的所有這些參數(shù)，避免mt分離和/或破膜造成的假象?，F(xiàn)在已經(jīng)有許多mt特異性熒光探針，可用于測(cè)量mtmP、mt質(zhì)量和mt內(nèi)ROS，見下表：

線粒體膜電位檢測(cè)原理和要點(diǎn)

mtmP是質(zhì)子運(yùn)動(dòng)動(dòng)力的主要組成部分，它是由mt基質(zhì)泵到膜間空間的質(zhì)子形成的。這種電位根據(jù)線粒體的狀態(tài)而變化，與它們合成ATP的能力有關(guān)，是細(xì)胞健康的常見指標(biāo)。mt基質(zhì)是負(fù)電位的，因此用于測(cè)量mtmP的染料通常是親脂性陽離子化合物，即帶正電荷的分子，它們可以跨膜而不會(huì)與膜結(jié)合，并與mtmP成正比地積聚在mt基質(zhì)中。超極化線粒體能積聚更多的染料，而去極化線粒體積聚的染料較少。

通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估mtmP時(shí)，必須考慮兩個(gè)要點(diǎn)：

首先，應(yīng)仔細(xì)滴定染料濃度。高染料濃度會(huì)導(dǎo)致熒光猝滅，從而產(chǎn)生結(jié)果異常。雖然淬滅閾值因染料而異，但一般1–30 nM的濃度算足夠低，大多能避免不必要的淬滅現(xiàn)象。

其次，必須使用功能性對(duì)照來確保染料信號(hào)的變化能得到正確解讀，避免非特異性改變。合適的對(duì)照包括：

1.作為解偶聯(lián)劑的FCCP、CCCP和valinomycin，誘導(dǎo)去極化。2.oligomycin，一種ATP合成酶抑制劑，誘導(dǎo)去極化。3.nigericin，K＋/H＋離子載體，誘導(dǎo)超極化。

不同線粒體膜電位染料優(yōu)缺點(diǎn)

DiOC6已廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)研究中，但是，DiOC6作為NADH抑制劑的活性，以及對(duì)mt的毒性，強(qiáng)烈限制了該探針的使用。

與DiOC6相似，羅丹明123（Rh123）初用于不少研究，不過Rh123雖然容易進(jìn)入細(xì)胞并迅速達(dá)到平衡，但不能很好地保留在里面。此外，在某些情況下，Rh123與線粒體的結(jié)合可能與線粒體能量狀態(tài)無關(guān)，這進(jìn)一步限制了其使用。

四甲基若丹明乙酯（TMRE）和四甲基若丹明甲酯（TMRM）也被廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mtmP，這些染料無毒，染色后不易淬滅，但應(yīng)以相對(duì)較低的濃度使用，可以在染色后立即進(jìn)行分析，無需洗滌。這兩種染料激發(fā)光均為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)574nm發(fā)射。通常，應(yīng)準(zhǔn)備未染色的樣品（也稱為“空白樣品”），以設(shè)置背景熒光的水平。因此，通過TMRE或TMRM分析mtmP的變化時(shí)，就被定義為給定樣品的MdFI的變化。

碳花青染料，尤其是JC-1被認(rèn)為是檢測(cè)mtmP的可靠探針。JC-1具有多色熒光發(fā)射光譜，并允許對(duì)mt去極化進(jìn)行比例式半定量評(píng)估。在單體狀態(tài)下，它發(fā)出綠色熒光（529 nm），而在高度依賴于mtmP的聚集狀態(tài)下，它發(fā)出橙紅色熒光（> 590 nm），在化合物誘導(dǎo)mtmP崩潰時(shí)，JC-1也會(huì)成為單體。這意味著，在健康細(xì)胞中，可以出現(xiàn)少量綠色，大多數(shù)為橙紅色熒光，線粒體去極化的細(xì)胞大多僅顯示綠色熒光。考慮到由于mtmP變化引起的熒光變化，顯示結(jié)果的j方法是指示mtmP高或低的細(xì)胞百分比，而不是綠色和橙紅色熒光之間的比率。

自1993年以來，據(jù)報(bào)道，JC-1是幾種細(xì)胞類型和測(cè)定條件的可靠膜電位指示劑，并且其與其他熒光探針的兼容性也已在多色方案中得到了證明。但是，JC-1對(duì)過氧化氫敏感、光敏感以及單體與聚集體形式之間的平衡速度較慢，可能會(huì)在一定程度上限制其使用。其它類似于JC-1的還有JC-9和JC-10，JC-9的單體或聚集體形式在522 nm激發(fā)，分別以535或635 nm發(fā)射。JC-10在490 nm激發(fā)，并在520 nm（單體形式）或590 nm（聚集形式）發(fā)射。

線粒體質(zhì)量檢測(cè)染料

線粒體質(zhì)量可通過使用能夠結(jié)合特定mt成分的染料進(jìn)行監(jiān)測(cè)，而與mt極化狀態(tài)無關(guān)。因此，熒光量與mt含量成正比。Mito ID和nonyl acridine orange（NAO）這兩種染料能與mt內(nèi)膜的cardiolipin結(jié)合，而MitoTracker染料與mt蛋白中存在的半胱氨酸殘基的巰基反應(yīng)。其中一些染料，包括MitoTracker deep red 633，也與mt蛋白形成共價(jià)鍵，因此在細(xì)胞染色后可以固定。與TMRE和TMRM類似的是，對(duì)于MitoTracker染料，應(yīng)測(cè)量MdFI的變化。

線粒體ROS檢測(cè)染料

關(guān)于mt ROS，近開發(fā)了兩種熒光探針，分別是MitoSOX和mi，以分別標(biāo)記線粒體中的陰離子超氧化物和過氧化氫。

MitoSOX是氫乙啶化合物，可靶向定位到線粒體，依賴mtmP積累到線粒體中，氧化后與線粒體DNA結(jié)合后發(fā)出熒光。與其他探針類似，當(dāng)使用MitoSOX和mi時(shí)，必須準(zhǔn)備足夠的陽性和陰性對(duì)照全面驗(yàn)證生物系統(tǒng)中mt H2O2的存在。Antimycin A或阿霉素是MitoSOX染色的j陽性對(duì)照，而外源H2O2則是mi的正確陽性對(duì)照。MitoSOX染色的陰性對(duì)照是細(xì)胞可滲透的超氧化物歧化酶模擬物或mt解偶聯(lián)劑，具體取決于細(xì)胞類型。對(duì)照的其它制備形式也可以用抗氧化劑來處理，例如N-乙酰半胱氨酸或其他能大大減少自由基產(chǎn)生的特異性清除劑。

目前已有不少文獻(xiàn)通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MitoSOX和mi進(jìn)行了測(cè)試，能選擇性定量角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和幾種癌細(xì)胞系中的mt陰離子超氧化物和mt過氧化氫，也有報(bào)道可能在同一細(xì)胞中同時(shí)使用MitoSOX和mi來分析活細(xì)胞中的mt ROS。