DNA 測(cè)序原理

DNA 測(cè)序技術(shù)主要依據(jù) Sanger 的雙脫氧鏈終止法。以 DNA 單鏈為模板，在特定條件下，用特異的引物在測(cè)序級(jí) DNA 聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，不斷將 4 種脫氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3''- 羥基末端并使引物鏈得到延伸。這種鏈的延伸是通過(guò)引物的 3''- 羥基和脫氧核糖核苷酸底物的 5''- 磷酸基團(tuán)形成磷酸二酯鍵來(lái)完成的。如果這種反應(yīng)體系中加入雙脫氧核糖核苷酸 (ddNTP) ，這種 2''3''ddNTP 的 5''- 磷酸基團(tuán)是正常的 (4 種不同的熒光標(biāo)記 ) ，而 3'' 位置缺少羥基，因此在 DNA 聚合酶作用下，仍然可以通過(guò) 5''- 磷酸基團(tuán)與引物鏈的 3''- 羥基反應(yīng)摻入到引物鏈中，但是由于 ddNTP 沒(méi)有 3''- 羥基，不能繼續(xù)與下一個(gè) 5''- 磷酸基團(tuán)形成磷酸二酯鍵而導(dǎo)致引物鏈延伸的終止。這樣，在測(cè)序反應(yīng)體系中， DNA 引物鏈不斷合成與偶然終止，產(chǎn)生一系列的長(zhǎng)短不等的核苷酸鏈，然后將這些反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，即可得測(cè)序圖譜。

樣品要求

測(cè)序結(jié)果常見(jiàn)的幾個(gè)問(wèn)題

1 、 為什么開(kāi)始一段序列的信號(hào)很雜亂，幾乎難以辨別?
這主要是因?yàn)闅埓娴娜玖蠁误w造成的干擾峰所致，該干擾峰和正常序列峰重疊在一起；另外，測(cè)序電泳開(kāi)始階段電壓有一個(gè)穩(wěn)定期，所以經(jīng)常有20-50 bp 的緊接著引物的片段讀不清楚，有時(shí)甚至更長(zhǎng)。

2 、 為什么在序列的末端容易產(chǎn)生 N 值，峰圖較雜?
由于測(cè)序反應(yīng)的信號(hào)是逐漸減弱的，所以序列末端的信號(hào)會(huì)很弱，峰圖自然就會(huì)雜亂，加上測(cè)序膠的分辨率問(wèn)題，如果堿基分不開(kāi)，就會(huì)產(chǎn)生 N 值，正常情況下ABI377測(cè)序儀能正確讀出500個(gè)堿基的有效序列。

3 、 測(cè)序結(jié)果怎么找不到我的引物序列?
如果找不到測(cè)序所用的引物序列。這是正常的，因?yàn)橐锉旧硎遣槐粯?biāo)記的，所以在測(cè)序報(bào)告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的擴(kuò)增引物，可能是您克隆的酶切位點(diǎn)距離您的測(cè)序引物太近，開(kāi)始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到擴(kuò)增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此時(shí)需找引物的互補(bǔ)序列。

4 、 測(cè)序結(jié)果怎么看不到我克隆的酶切位點(diǎn)?
可能的原因同上，您克隆的酶切位點(diǎn)距離您的測(cè)序引物太近，開(kāi)始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到酶切位點(diǎn)。通常我們會(huì)盡量選擇距離酶切位點(diǎn)遠(yuǎn)點(diǎn)的引物，當(dāng)然，若是樣品出現(xiàn)意外原因，如空載、載體自連等，克隆的酶切位點(diǎn)也是看不到的。

5 、 你測(cè)出的結(jié)果與我預(yù)想的不一致，給我的結(jié)果與我需要的序列有差距，這是怎么回事?
首先，我們會(huì)核實(shí)給您的測(cè)序結(jié)果是否對(duì)應(yīng)您的樣品編號(hào)，如果對(duì)應(yīng)的是您的樣品，由于不知您的實(shí)驗(yàn)背景，測(cè)得的序列是否與您預(yù)想的結(jié)果一致我們無(wú)法判斷，我們能做到的是檢查發(fā)送給您的測(cè)序結(jié)果和您提供來(lái)的樣品是否一致。

6 、 序列圖為什么會(huì)有背景噪音(雜帶)?是否會(huì)影響測(cè)序結(jié)果?
序列圖的背景雜帶是由熒光染料引起，如果太強(qiáng)會(huì)影響測(cè)序結(jié)果，要看信噪比，我們給的結(jié)果信噪比大都在98%以上。

7 、測(cè)序 結(jié)果為什么與標(biāo)準(zhǔn)序列有差別？
原因可能有： 樣品個(gè)體之間的差別、測(cè)序準(zhǔn)確率的問(wèn)題，自動(dòng)測(cè)序儀分析序列的準(zhǔn)確并非100%，建議至少測(cè)一次雙向，通過(guò)雙向測(cè)序可以zui大限度減少測(cè)序的錯(cuò)誤。當(dāng)然盡管我們有時(shí)做了zui大努力，但還是保證不了和文獻(xiàn)序列*一致，但我們測(cè)序報(bào)告是客戶樣品序列的真實(shí)結(jié)果。

8 、 PCR 產(chǎn)物測(cè)序與克隆后測(cè)序序列為什么有差別?
PCR 產(chǎn)物克隆到載體中進(jìn)行測(cè)序，有兩個(gè)方面可能序列有變化：首先， PCR 擴(kuò)增過(guò)程中可能產(chǎn)生錯(cuò)配。將片段克隆到載體中也有可能發(fā)生突變；其次，測(cè)序的準(zhǔn)確率并非100%。

9 、 有雜合位點(diǎn)，但你們的報(bào)告上看不到雜合的信號(hào)！
如果在您認(rèn)為應(yīng)該出現(xiàn)雜合信號(hào)的位置上只出現(xiàn)單一的信號(hào)，那么可能是您樣品突變的模板與正常的模板的比例沒(méi)達(dá)到可以測(cè)出的濃度。測(cè)序反應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度直接與模板的量有關(guān)，如果突變的模板所占的比例很低，儀器會(huì)自動(dòng)將它作為背景信號(hào)了，很難檢測(cè)出來(lái)。只有當(dāng)測(cè)序反應(yīng)體系中正常的和突變的模板量比較接近時(shí)，才能較可靠地檢測(cè)到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號(hào)強(qiáng)度一般是不一樣的，這樣即使突變的模板所占的比例較高時(shí)，也不一定能準(zhǔn)確檢測(cè)到突變的存在，因?yàn)椋瑴y(cè)序儀是主要用來(lái)測(cè)序正常的堿基序列的，軟件分析結(jié)果時(shí)，會(huì)盡量提高主峰而將背景信號(hào)盡量壓低，以得到盡可能好的結(jié)果。尊重結(jié)果，我們是不會(huì)人為將出現(xiàn)單一的信號(hào)修改為雜合位點(diǎn)的。

10 、 DNA 測(cè)序樣品用 TE 溶液溶解好不好?
由于 EDTA 是 Taq 聚合酶的一種潛在的抑制物, DNA 的測(cè)序反應(yīng)也是 Taq 酶的聚合反應(yīng)，需要一個(gè)*的酶反應(yīng)條件,因此 DNA 測(cè)序樣品溶解時(shí)，用滅菌水溶解。

11 、 我送什么形式的菌體樣品好?
菌體的一般形態(tài)有、菌液，平板培養(yǎng)菌、穿刺培養(yǎng)菌，甘油保存菌等。我們建議客戶所送的形態(tài)以方便且不易受污染為準(zhǔn)則，推薦穿刺培養(yǎng)菌。 上?？蛻粲眠^(guò)夜培養(yǎng)好的菌液2 ml 。

12 、 為什么你們給我的序列是反的?
測(cè)出來(lái)的結(jié)果與您預(yù)期的方向并不一致,可能是片斷插入方向是非定向的，這在 PCR 產(chǎn)物 T/A 克隆中較常見(jiàn)。有時(shí)，客戶要求的測(cè)序引物離克隆位點(diǎn)較近，如果反向引物相對(duì)克隆位點(diǎn)較遠(yuǎn)，為得到更好的結(jié)果，我們會(huì)選擇反向引物測(cè)序，若是這種情況，用看圖軟件 Chromas 可以把圖反轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，就可得到正向序列。

13 、 Template mixed 為何種情況?
測(cè)序結(jié)果表現(xiàn)為套峰，測(cè)序反應(yīng)信號(hào)很好，測(cè)序結(jié)果雜亂,即同一個(gè)位置有二個(gè)峰。
原因可能有：樣品并非單一模板、 PCR 產(chǎn)物中有雜帶、質(zhì)粒為雙克隆產(chǎn)物、引物特異性不高，有兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)， PCR 產(chǎn)物電泳時(shí)看不出，但測(cè)序結(jié)果能清楚地說(shuō)明這點(diǎn)。

14 、 polyT 或 polyA 后峰圖雜，怎么也要收費(fèi)?
這種情況一般表現(xiàn)為 A 、 T 連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)套峰，是樣品的內(nèi)在原因。這類問(wèn)題我們應(yīng)該同正常測(cè)序一樣，給客戶報(bào)告，反應(yīng)按正常收費(fèi)。

15 、 我的引物做 PCR 條帶很好，但為什么測(cè)不出序來(lái)？
并不是能做 PCR 反應(yīng)的引物都能測(cè)序，測(cè)序所用引物要求較高,必須與模板*匹配（有時(shí) 5'' 端可以有個(gè)別堿基的簡(jiǎn)并），引物長(zhǎng)度一般為20個(gè)堿基左右、 GC 含量適中，而且用于測(cè)序的引物一定要足夠純。

16 、如果 我的菌種培養(yǎng)得很好，測(cè)序應(yīng)該不會(huì)有問(wèn)題吧?
對(duì)于宿主菌，提倡使用宿主菌 DH5 α， DH1 、 和 C600 E.coli 菌株也可， XL1-Blue E.coli 菌株也不錯(cuò)，但其生長(zhǎng)過(guò)慢。 JM 系列、 TG1 系列和 HB101 系列 E.coli 菌株等由于產(chǎn)生大量的碳水化合物（即糖），而應(yīng)當(dāng)盡量避免使用；其它宿主菌可能會(huì)對(duì)測(cè)序造成影響。

17 、 為什么 G/C rich 的樣品沒(méi)結(jié)果或結(jié)果不好，照常收費(fèi)?
由于 G/C 連續(xù)結(jié)構(gòu)有時(shí)會(huì)造成反應(yīng)中途無(wú)法正常進(jìn)行，如果結(jié)構(gòu)在引物下游近處，反應(yīng)只有一小段的信號(hào)，有時(shí)甚至反應(yīng)根本沒(méi)信號(hào)。對(duì)于這種情況，本身就潛在不確定性的測(cè)序，有很大的失敗因素。

18 、 PCR 產(chǎn)物150 bp 以下的為什么不適于直接測(cè)序?
PCR 產(chǎn)物 150bp 以下的純化和定量都有一定困難，用于測(cè)序的 PCR 產(chǎn)物一般不低于150 bp 長(zhǎng)度。一個(gè)150 bp 的 PCR 產(chǎn)物用于測(cè)序，去掉兩個(gè)引物的序列大約40到50 bp ， 再加上測(cè)序起始端的一些讀不好的堿基，真正能夠得到的有用序列不過(guò)幾十堿基。這只是的假設(shè)，這么短片斷測(cè)序失敗的幾率非常大，因此只能克隆后再進(jìn)行測(cè)序。

19 、 我的質(zhì)粒樣品很好，測(cè)序結(jié)果怎不好?
由于原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)如發(fā)卡和回文結(jié)構(gòu)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)突然信號(hào)減弱或消失；有時(shí)測(cè)序根本不能進(jìn)行下去， DNA 堿基排列并無(wú)特別異常，可能是 DNA 整體出現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。

20 、 我的樣品還保留了嗎?我想現(xiàn)在反向再測(cè)一個(gè)反應(yīng)。
出于保密原則我們測(cè)序樣品只保留一個(gè)月，所以若要再測(cè)序，請(qǐng)抓緊時(shí)間，否則只有重新送樣。

21 、 已經(jīng)測(cè)通了樣品，但重疊的地方有錯(cuò)配，是為什么?
測(cè)通的全序列是拼接后的結(jié)果，由于拼接處一般是在一次測(cè)序的末端和次個(gè)反應(yīng)開(kāi)始一段，通常會(huì)有一定的雜帶，以序列信號(hào)好的為主，次的為參考，但也不。