一、要求

1、熟悉細(xì)胞周期的基本概念、原理，掌握實驗操作的流程和方法。

2、觀察流式細(xì)胞儀檢測、分析細(xì)胞周期的各種峰形圖的意義。

3、了解細(xì)胞周期測定實驗的用途。

二、原理

細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時間。細(xì)胞周期反映了細(xì)胞的增殖速度，周期越短說明細(xì)胞的增殖速度越快。測定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計數(shù)法和流式細(xì)胞儀測定法等。流式細(xì)胞儀測定法是利用溴化乙錠（PI）滲入測定細(xì)胞周期的方法。溴化乙錠加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含溴化乙錠的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。

三、材料

1、秋水仙素。

2、溴化乙錠（1.0mg/ml）。

3、無水乙醇。

4、RPMI1640*培養(yǎng)基。

5、RNase A (1mg/mL)。

6、PBS。

7、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

8、離心機。

9、流式細(xì)胞儀。

10、細(xì)胞培養(yǎng)箱。

四、方法

1、取1×106對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整好細(xì)胞生長狀態(tài)。

2、離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗滌兩次。

3、加入預(yù)冷70％乙醇0.5ml，于4℃固定30分鐘。

4、離心收集細(xì)胞，取1mL PBS洗滌一次，加入0.2ml反應(yīng)液(含50靏/mL溴化乙錠，100靏/mL RNase A和0.2% Triton X-100 的PBS)，4℃避光孵育30分鐘。

5、PBS洗滌兩次，用流式細(xì)胞儀檢測分析。

五、注意事項

1、實驗操作過程中動作要盡量輕柔，不可用力打碎細(xì)胞。

2、RNA酶現(xiàn)加，以*去除細(xì)胞中RNA的干擾。

3、溴化乙錠是光敏物質(zhì)，操作過程中注意避光。

4、zui后一步的洗滌應(yīng)盡量棄凈上清，以免游離PI殘留影響實驗結(jié)果。

   上述文獻(xiàn)僅供參考，不作為實驗依據(jù)，具體詳情需要自行實驗數(shù)據(jù)理論為基準(zhǔn)，上海青旗是一家集產(chǎn)品，技術(shù)，服務(wù)，售后等一站式的生物公司，為廣大科研人員提供各類血清；動/人正常/人腫瘤細(xì)胞；ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株等。我們的宗旨是以：高品質(zhì)、低價格、供貨快、售后好為基準(zhǔn)，為廣大科研實驗工作者提供的服務(wù)。