冰凍切片應(yīng)用SP免疫組化染色法的體會(huì)

　鏈霉菌親生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法（streptavidin×idaseConjugatedmethodsp法）［1、2］是美國(guó)Zymed公司于1986年*的免疫組化方法。我們用sp法研究了sars冠狀病毒（sars-cov）s蛋白的功能性受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ace2）在大鼠內(nèi)臟尤其在胰腺內(nèi)外分泌腺的表達(dá)，效果滿(mǎn)意?，F(xiàn)結(jié)合我們所做的實(shí)驗(yàn)對(duì)免疫組化程序中的一些主要技術(shù)問(wèn)題總結(jié)如下。 

　　1、材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

250g左右成年健康雄性Wistar大鼠（20只），4周齡，中國(guó)醫(yī)學(xué)*動(dòng)物所提供。

1.2 主要試劑

羊抗鼠ace2多克隆抗體（santacruse公司），sp試劑盒（美國(guó)Zymed公司），二氨基聯(lián)苯胺（daB），0.01mmol/l，ph7.4磷酸緩沖液（pBs），胎牛血清白蛋白（Bsa）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

麻醉動(dòng)物取內(nèi)臟組織制作冰凍切片，用含0.1%Bsa的pBs沖洗震蕩（以下所用pBs均含0.1%Bsa），10min×2，3%H2O2去離子水避光孵育20min，蒸餾水充分沖洗后搖床震蕩15min，再用pBs浸泡5min。先后滴加20%-30%雞蛋清液、封閉用正常兔血清工作液及1%Bsa，各室溫孵育20min，傾去，勿洗。滴加1∶50稀釋的一抗，4℃隔夜，pBs充分沖洗震蕩，10min×6，滴加二抗（生物素標(biāo)記的兔抗山羊igg工作液），37℃溫箱孵育15min，pBs充分沖洗震蕩，10min×6，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃溫箱孵育15min，pBs充分沖洗震蕩，10min×6。daB顯色，同時(shí)在顯微鏡下觀察顯色狀況，顯色*后用自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，封片。用pBs代替一抗作為陰性對(duì)照。

　　2、體會(huì)

2.1 抗體的保存

抗體是免疫組化zui基本的試劑，因?yàn)榭贵w是蛋白質(zhì)構(gòu)成，保存或使用不當(dāng)，不但會(huì)造成浪費(fèi)，而且試劑變質(zhì)會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。對(duì)即用型試劑在4℃冰箱保存，盡量縮短滴加抗體時(shí)間，并在有效期內(nèi)使用，對(duì)原裝濃縮液的抗體，提倡用等量滅菌甘油混合（分裝更佳，防止長(zhǎng)時(shí)間用槍頭吸取污染的可能），一般2L一個(gè)包裝。抗體及s-p試劑盒均應(yīng)放置低溫冰箱貯存，用1支取1支，一次用不完的抗體保存在4℃冰箱內(nèi)（不超過(guò)1個(gè)月），而不要放在冰格室，因?yàn)樵谀抢锟贵w會(huì)很快結(jié)冰，再次使用時(shí)又要融解，這樣反復(fù)凍融，抗體效價(jià)會(huì)急劇下降。

2.2 非特異性染色在免疫組化的實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中常會(huì)遇到非特異性染色這一問(wèn)題，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定造成嚴(yán)重影響。

2.2.1 所選擇的抗體是否符合實(shí)驗(yàn)要求

因抗原不純、標(biāo)本片中含有與靶抗原相似的抗原決定簇等原因造成的非特異性染色只能通過(guò)采用高純度、價(jià)的抗體或針對(duì)更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來(lái)解決。檢查二抗與標(biāo)本的內(nèi)源性組織蛋白是否有交叉反應(yīng)?？贵w稀釋?xiě)?yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對(duì)于pBs稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。

2.2.2 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素是否充分封閉

3%H2O2去離子水避光孵育20min可以*封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。

我們以大鼠內(nèi)臟為研究對(duì)象，內(nèi)源性生物素含量非常豐富，通過(guò)反復(fù)摸索，我們用20%-30%雞蛋清液室溫孵育20min（傾去勿洗），可以*封閉內(nèi)源性生物素，得到干凈的陰性片子。有報(bào)道說(shuō)也可以用卵白素封閉［3］。

2.2.3 是否選擇使用了正確的封閉血清

電荷吸附所造成的非特異性背景染色，我們用正常兔血清工作液及1%Bsa消除。

2.2.4 清洗是否充分

因在緩沖液中含有一定量的鹽，這亦有利于減低背景著色，通常0.05mol/ltris-hcl，0.15mol/lnacl已適用于多數(shù)染色方法，我們用0.01mmol/l，ph7.4磷酸緩沖液長(zhǎng)時(shí)間、大幅度地震蕩清洗，累計(jì)清洗時(shí)間達(dá)3h，效果滿(mǎn)意。清洗完畢后應(yīng)去除清洗液，如果切片上了過(guò)多的清洗液，當(dāng)抗體加至切片上時(shí)，等于人為地對(duì)抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋。

2.2.5 daB的使用是否正確

daB是目前顯色劑，陽(yáng)性著色為棕褐色，耐受化學(xué)試劑，敏感性高。我們滴加daB后在顯微鏡下觀察顯色狀況，避免過(guò)染，否則背景模糊，待顯色*后用自來(lái)水充分沖洗。daB的孵育時(shí)間和配制方式可以產(chǎn)生某些背景顏色，使用濃縮型daB試劑盒時(shí)，請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的滴加順序操作，注意校正蒸餾水的ph值，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性；粉劑daB溶解時(shí)，常有一些不溶性顆粒，這些顆粒須經(jīng)過(guò)濾除去，否則可能沉積于切片組織上，產(chǎn)生斑點(diǎn)狀著色。另外，daB保存不妥產(chǎn)生氧化物亦可沉積于切片上，因此需將daB保存于避光干燥處，要新鮮，現(xiàn)用現(xiàn)配，放置不超過(guò)半小時(shí)。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)造成背景染色。

2.2.6 一抗的使用濃度是否過(guò)高

預(yù)實(shí)驗(yàn)中，將一抗的濃度定位在1∶50-1∶500之間，逐個(gè)摸索，以得到*濃度稀釋比例。

2.2.7 標(biāo)本染色過(guò)程中是否曾經(jīng)干涸

標(biāo)本干涸會(huì)造成邊緣部的非特異性染色。加入試劑后一定要放入孵育盒內(nèi)（特別是胰酶消化），每次滴加試劑要適量，防止孵育時(shí)間未到，試劑已揮發(fā)，出現(xiàn)假陽(yáng)性；也不能使組織切片干涸后再加試劑，染色易出現(xiàn)陽(yáng)性。

2.2.8 蘇木素復(fù)染

經(jīng)常出現(xiàn)過(guò)染現(xiàn)象，漿核藍(lán)染過(guò)深。根據(jù)分化劑能選擇性地除去染劑的原理，用0.5%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水沖洗1min藍(lán)化，即清除過(guò)染的蘇木素，也起到了清潔組織片的作用。

我們復(fù)染的步驟如下：蘇木素（10min以上）→水→鹽酸→水→氨水→酒精1→酒精2→酒精3→二甲苯→中性樹(shù)膠封片。

2.3 其他

免疫組織化學(xué)染色的成功與否，除取決于試劑的質(zhì)量及染色各環(huán)節(jié)的操作外，在很大程度上還取決于標(biāo)本取材、固定、切片等染色前準(zhǔn)備工作。這些準(zhǔn)備工作如果處理不當(dāng)，在隨后的染色過(guò)程中往往無(wú)法補(bǔ)救，導(dǎo)致染色失敗。

2.3.1 對(duì)照

每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)立對(duì)照片。如果沒(méi)有對(duì)照，片子是否出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，實(shí)驗(yàn)者自己都搞不清楚。陽(yáng)性對(duì)照片靠積累，陰性對(duì)照我們用pBs代替一抗進(jìn)行。二抗、三抗等步驟不和陰性對(duì)照片放在一起沖洗。

2.3.2 時(shí)間和溫度

孵育時(shí)間和溫度對(duì)提高抗原抗體的結(jié)合率，增強(qiáng)免疫反應(yīng)有重要意義。孵育時(shí)間過(guò)短，抗原抗體結(jié)合不夠充分，染色較淺。延長(zhǎng)孵育時(shí)間，將一抗孵育于4℃隔夜；二抗、三抗在37℃孵育15min，結(jié)果表明延長(zhǎng)孵育時(shí)間后特異性免疫反應(yīng)明顯增強(qiáng)，染色明顯加深，陽(yáng)性反應(yīng)率也明顯提高。

2.3.3 取材、固定、切片

對(duì)病變的選材應(yīng)盡量避開(kāi)出血及壞死部位。常用的固定劑有甲醛、戊二醛、乙醇、丙酮等。切片時(shí)所用載玻片需涂抹粘片劑，以防脫片。切片質(zhì)量的好壞，直接影響染色的效果。我們采用冰凍切片，均是麻醉大鼠后立即取材、切片，都為同一個(gè)組織的連續(xù)切片，丙酮固定10min，放4℃冰箱保存，放置時(shí)間一般不超過(guò)2周。

2.3.4 抗體與抗原的匹配

使用的一抗必須和二抗匹配，這一點(diǎn)非常重要。比如一抗是兔來(lái)源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來(lái)匹配；一抗是小鼠的igm抗體，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的igm二抗。

2.3.5 沖洗液與反應(yīng)試劑的匹配

沖洗液必須和反應(yīng)試劑匹配，溶液的ph值十分重要。

　3、討論

鏈霉菌親生物素蛋白是從一種鏈菌素分離出的不含糖基鏈的蛋白質(zhì)，含有4個(gè)亞基，每個(gè)亞基有1個(gè)和生物素親和力*的結(jié)合點(diǎn)。與aBc復(fù)合物不同，它僅標(biāo)記過(guò)氧化物酶而本身并沒(méi)有與生物素連接，生物素是直接連接在第二抗體上，故其分子量比aBc復(fù)合物小，滲透組織的能力更強(qiáng)、反應(yīng)速度更快、敏感性更高。此外，因其本身不含糖基鏈，等電點(diǎn)為6.5，接近中性，幾乎不與組織中的內(nèi)源性凝集素樣物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，從而產(chǎn)生了低背景、高放大的效果。人們對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶已有了充分認(rèn)識(shí)，過(guò)氧化氫法可有效消除組織中的過(guò)氧化物酶活性，從而達(dá)到避免非特異性染色的目的，而很久以來(lái)對(duì)內(nèi)源性生物素產(chǎn)生的影響幾乎沒(méi)有采取任何措施。其實(shí)，內(nèi)源性生物素對(duì)免疫組化染色的影響程度遠(yuǎn)高于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，其在組織中主要以顆粒狀形式存在于胞質(zhì)中，并且廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織。免疫組化s-p法是應(yīng)用生物素-卵白素或生物素與鏈酶卵白素檢測(cè)系統(tǒng)，屬于親和素-生物素法之一。內(nèi)源性生物素易結(jié)合后繼抗體，形成親和素（或鏈親和素）-生物素復(fù)合物，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，勢(shì)必影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定。

　　免疫組化染色的成敗，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)研究的成敗，免疫組化染色中一個(gè)環(huán)節(jié)注意不到，都將影響結(jié)果。這方面的研究還需要我們不斷總結(jié)，才能為臨床與科研提供診斷及治療的有力依據(jù)。