人游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒使用說明書
人游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!
檢測范圍:0.47nmol/ml-30nmol/ml，繪制標準曲線請取用以下濃度值:30nmol/ml，15nmol/ml，7.5nmol/ml，3.75nmol/ml，1.88nmol/ml，0.94nmol/ml，0.47nmol/ml。
zui低檢測限:0.12nmol/ml
實驗原理:用純化的FFA抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的FFA抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FFA呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（值），計算樣品濃度。
預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中FFA含量。
人游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒組成及試劑配制:
1.酶標板:一塊（96孔）
2.標準品（凍干品）:2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為30nmol/ml，然后做系列倍比稀釋（注:不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成30nmol/ml，15nmol/ml，7.5nmol/ml，3.75nmol/ml，1.88nmol/ml，0.94 nmol/ml，0.47 nmol/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔0 nmol/ml。如配制15 nmol/ml標準品:取0.5ml（不要少于0.5ml ）30 nmol/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3.樣品稀釋液:1×20ml。
4.檢測稀釋液A:1×10ml。
5.檢測稀釋液B:1×10ml。
6.檢測溶液A:1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如:10檢測溶液A/990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100/孔），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。
7.檢測溶液B:1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.底物溶液:1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液:1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液:1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11.覆膜:5張
12.使用說明書:1份
自備物品:
1.酶標儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）;
2.微量加液器及吸頭，EP管;
3.蒸餾水或去離子水，濾紙;
標本的采集及保存:
1.血清:全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于1000g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.其它生物標本：請1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4.樣本處理:血清或血漿標本推薦稀釋100倍，如:稀釋100倍，取10uL血清或血漿加入990uL樣品稀釋液。標本使用0.02M 的PBS稀釋（PH=7.0-7.2）。
注:以上標本均應(yīng)密封保存，4保存應(yīng)小于1周，-20不應(yīng)超過1個月，-80不應(yīng)超過2個月；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟:
實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37溶解；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1.加樣:分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00，余孔分別加標準品或待測樣品100，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100（臨用前配制），酶標板加上覆膜，37 溫育1小時。
3.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4.每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37溫育1小時。
5.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6.每孔加底物溶液90，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。
7.每孔加終止溶液50，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。
8.立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（值）。
注：
1.試劑準備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2.加樣:加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗。
3.溫育:為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài)；同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4.洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。
5.試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ），以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。
6.反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
7.底物:底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
洗板方法:
1.手工洗板方法:將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
2.自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的人FFA，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算:各標準品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點圖），如設(shè)置復(fù)孔，則 應(yīng)取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標）， 值為橫坐標（對數(shù)坐標），在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品 值，由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
說明:
1.由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。
2.zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準備充足的標本備份。
3.在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
4.試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20 ，其余試劑短期保存請置于4 ，長期保存則置于-20 。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于-20 ，避免潮濕。
5.濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
6.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
7.有效期：6個月。
